曾遭受「假陰性」質疑的核酸檢測為何是診斷金標準?

2020-12-22 健康一線視頻網

文 | 忠偉

新型冠狀病毒肺炎疫情在國內已逐漸平穩，全球疫情卻正處爆發期。當各國不得不開始重視起疫情的控制時，首先要解決的就是新型冠狀病毒的檢測問題。回顧國內的抗疫歷程，我們很早就確立了核酸檢測作為新型冠狀病毒肺炎的診斷金標準，但曾有很多臨床醫生強烈反映核酸檢測出現了「假陰性」的情況，即對於一些臨床、影像學和流行病學特徵都高度提示新冠的患者，核酸檢測結果卻為陰性，甚至有的患者需要3次以上核酸檢測才第一次返回陽性結果。要理解並解決「假陰性」的問題，我們需要對新型冠狀病毒的檢測原理和過程有一個基礎的了解。

一、新型冠狀病毒核酸檢測，到底在檢測什麼？

新型冠狀病毒的檢測目前有2種方法，第一種是核酸檢測，第二種是抗體檢測。核酸檢測的對象是病毒的RNA，抗體檢測的對象是機體在免疫過程中產生的與病毒蛋白特異性結合的抗體。如圖1所示，RNA位於新型冠狀病毒顆粒的核心，病毒顆粒外周的殼膜則由蛋白質組成。

RNA可以理解為病毒的遺傳密碼，是由數萬個密碼子連接而成的單鏈密碼串。對RNA的檢測實際上只需要選擇這長串密碼中特異性的位點，如果特異性位點中的密碼序列符合，那麼就可以確認標本中存在新型冠狀病毒。實際檢測中，現有的核酸檢測都是檢測DNA的，所以在對標本處理得到基因組RNA之後，往往需要將RNA逆轉錄為互補的cDNA。螢光RT-PCR是目前使用最廣泛的新型冠狀病毒核酸檢測方法，因其具有優異的靈敏度和特異性並且快速簡單成本低。螢光RT-PCR的原理是首先把cDNA在PCR反應體系中進行擴增並使用螢光進行標記，每擴增一條DNA 鏈，就有一個螢光分子產生（圖2）。通過測定螢光達到一定閾值所需擴增循環數（Ct 值）來實現靶標定量檢測。初始靶標核酸的濃度越高，Ct 值越小。由於SARS-CoV-2屬於RNA病毒，容易發生變異，為防止錯檢和漏檢，PCR檢測一般會分別在ORF1ab基因、N基因選取2個靶標，有時還會在E基因上選取第3個靶標，以提高SARS-CoV-2的陽性檢出率。

全基因組測序是新型冠狀病毒檢測的另外一種核酸檢測方法。對病毒進行全基因組測序 可以幫助我們了解病毒的遺傳信息，最初新型冠狀病毒的鑑別就是通過基因測序進行的，測序結果可以用於指導核酸檢測產品（如螢光RT-PCR）的設計，並對病毒進行追蹤和溯源。測序技術的最大優勢在於高敏感性、高準確性，但測序技術由於儀器成本較高，依賴於專業人員對序列的解讀，且檢測時間較長，目前還不適用於大規模檢測。此外，其他核酸檢測方法還包括液滴數字PCR，基因晶片等，這些核酸檢測方法可以進一步改善檢測的效率和精度，但由於設備和操作流程要求較高，也不適合緊急疫情期間的大規模應用。由於RNA病毒容易發生變異，為防止錯檢和漏檢，用於SARS-CoV-2檢測的PCR檢測一般會分別在ORF1ab基因、N基因選取兩個靶標，有時還會在E基因上選取第3個靶標，以提高SARS-CoV-2的陽性檢出率。

新型冠狀病毒抗體檢測原理是基於抗體與抗原的特異性結合這一特性，抗體是人體免疫系統產生用於對抗抗原的物質。在人體感染SARS-CoV-2後，病毒會作為抗原刺激人體免疫細胞產生抗體，因此可以通過檢測人體內是否產生特異性的抗體來間接檢測是否感染SARS-CoV-2。檢測的抗體主要分為免疫球蛋白M（IgM）和免疫球蛋白G（IgG）兩類。lgM是機體初次免疫應答產生的抗體，一經感染，立即產生，但持續時間不長，主要作為早期感染的指標。lgG是機體再次免疫應答產生的抗體，產生時間晚，持續時間長，主要作為感染和既往感染的指標。一般認為在發病7天後體內才開始出現IgM抗體，發病15天後開始出現IgG抗體。同時檢測lgM、lgG抗體可以提高檢測的準確性，減少漏診。抗體檢測的樣本主要是血清、血漿或全血。目前使用最廣泛的新型冠狀病毒抗體檢測方法為免疫色譜試紙條，其原理為預先在試紙條的檢測線（T線）上固定抗體（抗原檢測）或抗抗體（抗體檢測），在控制線（C線）上固定二抗，結合墊帶有免疫標記的探針。一般探針為膠體金、乳膠粒子或螢光微球等具有比色或螢光信號的微顆粒。在樣品墊中加入待測樣本，樣本流至結合墊時，通過抗原–抗體相互作用與探針結合，形成樣本–探針複合物。當流動至T線時，複合物會被T線上的抗體或者抗抗體捕獲，形成標記三明治夾心結構複合物，使T線顯色。T線和C線同時顯色表明待測標本中含有病毒的抗原或者抗體，只有C線則表明無病毒抗原或抗體。免疫色譜試紙條法無需複雜的儀器，操作簡單，可直接目視判定結果，檢測時間只需十幾分鐘，適合於現場快速篩查。但其準確度和靈敏度有限，可以作為新型冠狀病毒檢測的輔助方法。

二、核酸檢測為什麼是診斷金標準，「假陰性」如何解釋？

核酸檢測之所以是新型冠狀病毒肺炎診斷的金標準，是因為核酸檢測在本質上是一種病原學檢測，即在標本中檢測到了SARS-CoV-2特有的基因片段，那麼除非標本被汙染，可以肯定患者存在SARS-CoV-2感染。目前嚴格執行"三個陰性樣本隨機放在臨床標本中間同時參與檢測全過程"的質控策略，可以有效而及時地識別出標本被汙染的情況。臨床醫生曾反映強烈的核酸檢測"假陰性"概念，往往指的是患者的臨床症狀及影像學證據高度疑似新型冠狀病毒肺炎，但2019-nCoV核酸檢測多次或始終為"陰性"。而對於檢驗實驗室而言，假陰性指的是所採集標本中存在有足夠量的病毒，但卻沒有被檢出。導致「假陰性」的可能原因包括：

被感染者細胞內的病毒量不足：不同病程階段以及機體不同部位存在的病毒量有所不同，例如感染初期可能體內病毒量較低而無法檢出；不同部位中，肺泡灌洗液中最容易檢出病毒核酸，其次是深咳痰，再是鼻咽部，再次是口咽部。

標本採集時未採集到含病毒的細胞：採集部位不當，如採集口咽拭子時，採集深度不夠；採集鼻咽拭子沒有採到鼻腔深處等，則可能採集到的細胞絕大部分都是不含病毒的細胞。

檢測試劑的可靠性不足：任何一種檢測試劑的檢測範圍都存在下限，病毒數量低於檢測下限時是無法檢出的。此外，若原始標本中病毒數量低於一定程度，就很可能在核酸擴增檢測的反應體系中沒有病毒核酸，試劑也就無法檢出。

實驗室質量控制不規範：例如未嚴格遵守標本運輸的溫度和時間要求，檢測操作或者結果判讀不嚴謹等。

根據中華醫學會檢驗醫學分會發布的《新型冠狀病毒肺炎病毒核酸檢測專家共識》，新型冠狀病毒檢測陽性結果的報告要求滿足以下任一條：（1）ORF1ab和N基因同時陽性時，判定為陽性；（2）若僅ORF1ab或N基因其中之一檢測結果陽性時，需重新提取原標本的核酸進行複查，複查後ORF1ab或N基因仍為陽性時，判定為陽性。陰性結果的報告要求為兩個位點擴增結果都無反應。其餘情況都認為「可疑結果」，需要換用不同廠家或者敏感度更高的檢測方法進行確認，並建議建議臨床重新採集標本或更換部位採集標本再次檢測。對於核酸檢測報告的陰性結果，需要結合患者的臨床特徵進行綜合判定，如果患者的症狀、流行病學和胸部CT表現都高度提示感染時，很可能是因為標本中病毒量低於檢測下限而未被檢出，該情況下建議重新採集標本或者更換標本採集部位後再次檢測。

三. 目前已有哪些可商用的新型冠狀病毒檢測試劑？

截至目前，國家藥品監督管理局共批准新冠病毒核酸檢測試劑11個，抗體檢測試劑8個（如圖4）需要注意的是，正常情況下一種檢測試劑在臨床應用之前都需要進行性能驗證，以確保檢測試劑的性能可以滿足臨床需要，但疫情突發，已獲批的所有新型冠狀病毒檢測試劑都是屬於應急審批，所有的檢測試劑產品都未經過充分的性能驗證。即便如此，通過應急審批的檢驗試劑也很大程度地滿足了國內新型冠狀病毒肺炎診斷的需求。此外，在保障我國病毒檢測需要的基礎上，已有越來越多的國產冠狀病毒檢測試劑獲得歐盟認證或經NGO機構進行捐贈，馳援全球。

參考文獻：[1]國家衛生健康委辦公廳.新型冠狀病毒肺炎診療方案（試行第七版）. 2020年3月3日印發.

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[4]中華醫學會檢驗醫學分會. 新型冠狀病毒肺炎病毒核酸檢測專家共識 [J] . 中華醫學雜誌,2020,100( 00 ): E003-E003. DOI: 10.3760/cma.j.issn.0376-2491.2020.0003

[5]張瑞, 李金明. 如何減少新型冠狀病毒核酸檢測的"假陰性" [J] . 中華醫學雜誌,2020,100( 00 ): E008-E008. DOI: 10.3760/cma.j.issn.0376-2491.2020.0008

[6]王露瑩,陳品儒,鄭國灣,漆楠,楊科.新型冠狀病毒檢測方法的研究進展[J/OL].現代藥物與臨床:1-5.

[7]澎拜新聞. 首先質量要過關！首個新冠病毒檢測試劑盒誕生全程復盤. 來源：https://www.thepaper.cn/newsDetail_forward_5754281

[8]第一財經. 共擊疫情，中國新冠病毒檢測試劑盒馳援全球.來源：https://www.yicai.com/news/100561666.html

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