【科研摘要】
為再生醫學應用定製合成水凝膠的常用方法包括摻入RGD細胞粘附肽，但是在納米級評估對工程微環境的細胞反應仍然具有挑戰性。迄今為止，尚無研究證明水凝膠中RGD的濃度如何影響單個細胞表面受體的表達。11月，帝國理工學院Molly Steven教授團隊通過關聯宏觀和納米尺度的單細胞界面定量技術研究了人類間充質幹細胞（hMSCs）和RGD功能化的聚（乙二醇）水凝膠之間的相互作用。相關論文題為Nanoscale Molecular Quantification of Stem Cell–Hydrogel Interactions發表在《ACS Nano》上。作者使用單細胞原子力光譜法對合成水凝膠上的RGD解除結合力進行了定量，揭示了hMSC的短期結合對RGD濃度敏感。還進行了直接隨機光學重建顯微鏡（dSTORM）來量化整聯蛋白α5β1與生物材料之間的分子相互作用，出乎意料地揭示出，整聯蛋白在水凝膠-細胞界面處的聚集增加與可用的RGD結合位點較少相關。該定量方法揭示了對特定幹細胞-水凝膠相互作用的機理見解，其中dSTORM對整聯蛋白α5β1的細胞表面定位中RGD依賴的差異提供了納米靈敏度。研究結果發現，有可能精確確定肽官能化的水凝膠如何在分子水平上與細胞相互作用，從而為微調生物活性配體的空間表現提供基礎。
【圖文解析】
1.水凝膠的製備和技術開發
的技術方法，使用了與hMSCs相連的RGD肽功能化水凝膠作為模型系統。將基於8臂，20 000 Da的PEG-降冰片烯的聚乙二醇（PEG）水凝膠與不同濃度的共價連接的線性細胞粘附RGD肽（CGGRGDSP）進行光交聯，其中存在RGD序列在纖連蛋白和一些其他細胞外基質蛋白中，它們結合了幾種細胞表面受體，尤其是整聯蛋白α5β1。整合素結合的RGDSP基序以前曾用於促進細胞與基於PEG的水凝膠的附著，並且發現PEG水凝膠中的束縛RGD肽對於封裝的hMSC生存是必需的。由於其線性，因此作者選擇使用線性RGDSP肽與大多數形式的環狀RGD相比，對整合素α5β1的結合親和力更高。基於PEG的硫醇-降冰片烯「 photoclick」水凝膠提供了一種高度通用且受良好控制的平臺來探測細胞與材料的相互作用。在光引發劑和紫外光的存在下，將8臂PEG大分子單體與不可降解PEG-1000二硫醇接頭和拴系的RGD肽以2：1接頭：肽的摩爾比交聯成網絡（圖1a）。
圖1.幹細胞-水凝膠界面示意圖。
SCFS是一種原子力顯微鏡（AFM）技術，可提供分子對單細胞與材料相互作用的洞察力.SCFS以前僅在少數研究中用於測量單細胞與材料之間的解鍵力，以鑑定分子相互作用並闡明初始粘附機制，但據悉，尚未將這種凝膠用於具有特定的細胞-粘合劑相互作用的水凝膠。它是表徵細胞表面相互作用的有價值的工具，具有高度敏感但可測量的力範圍很廣（10-100 nN），並且具有精確的空間和時間控制。在作者的實驗裝置中，單個hMSC被粘附到功能化的AFM懸臂和與水凝膠接觸（圖1b）。撤回與hMSC綁定的懸臂後，可以精確地測量單個解離事件。 hMSCs懸臂的連接是由伴刀豆球蛋白-A細胞膜糖蛋白相互作用介導的（圖1c）。通常，dSTORM是在非常薄的樣品上進行的，但是在此，作者將介紹一種適用的設置，該設置可使dSTORM在與水凝膠相互作用的細胞上成像。通過對倒置的水凝膠成像並將雷射聚焦在界面膜上，分析了與RGD水凝膠接觸的hMSC表面上RGD結合細胞表面受體整聯蛋白α5β1的可用性（圖1d）。
2.RGD可用性決定了hMSC在肽功能化水凝膠上遷移。
hMSC在體內的關鍵作用是其遷移到損傷部位的能力。該遷移受hMSC與其底物的粘附影響。觀察與高和低RGD水凝膠結合的hMSC，發現細胞形態受到RGD量的顯著影響，在100％RGD上表現出更廣泛的形態，在10％RGD上表現出紡錘形（圖2a）。接下來，作者表徵單個hMSC的遷移，以確定RGD細胞粘附肽的濃度是否對細胞的宏觀行為有影響。在6小時內進行了實時螢光成像（圖2b），發現在高結合力和低結合水凝膠上的hMSCs沒有顯示出方向性偏好（圖2c）。有趣的是，與100％RGD水凝膠上的1.7μm/ min相比，在10％RGD水凝膠上的hMSC在水凝膠表面的移動速度更快，中位速度為2.6μm/ min（圖2d）。此外，在10％RGD水凝膠上的hMSC遷移更遠，中位位移為488μm，而在100％RGD水凝膠上則為314μm（圖2e）。這些實驗證明並證實了RGD肽的可用性影響形態和遷移行為。
圖2. hMSC在RGD水凝膠上的遷移分析。
3.使用單細胞力譜圖繪製hMSC-RGD解鍵力
SCFS用於研究RGD濃度對hMSC與水凝膠之間粘附力的影響，從而提供分子水平的見解來解釋遷移速度的差異。在SCFS測量過程中，可以將懸臂撓度（力）的變化測量為將細胞拉開並與水凝膠完全分離（圖3a）。在這裡，作者已經量化了hMSC和水凝膠之間相對於RGD濃度的納米級和皮秒級粘附力。首先，對在變化的RGD濃度的水凝膠上的回縮曲線下的面積（圖3a中標註的藍色區域）進行積分，從而量化了將hMSC與水凝膠完全分離所需的粘附能（圖3b）。在hMSC與水凝膠相互作用的力-距離曲線中，觀察到典型的破裂事件（圖3A，插圖框），特別是力階躍（或「跳躍」），之後是力的斜坡狀變化。對全部破裂事件進行了量化（圖3c），並且將高斯擬合應用於高達200 pN的力分布。對單個破裂事件的進一步分析表明，SCFS對水凝膠中RGD的可用性敏感。對於100％RGD水凝膠，在單次力距曲線中檢測到的總破裂事件（NT）的平均數（圖3d）幾乎是10％RGD水凝膠的NT的兩倍（178％）。
圖3.從水凝膠表面分離的hMSC的單細胞力光譜。
4.使用dSTORM表徵整聯蛋白α5β1hMSC表面聚類
作者著手量化粘附在RGD功能化水凝膠上的hMSC質膜表面上α5β1整合素的數量和排列。在它們的活性，擴展構象中進行免疫標記α5β1整聯蛋白可以評估整聯蛋白與配體結合的表面可用性（圖4a）。與100％RGD水凝膠相比，含10％RGD水凝膠的細胞-材料界面處的α5β1利用率顯著增加（圖4b）。使用聚類分析算法Clus-DoC基於噪聲的應用程式的基於密度的集成空間聚類（DBSCAN）功能，（50）識別出α5β1聚類，並在感興趣區域（ROI）內生成了聚類圖及其密度 為4×4μm（圖4c和d）。通過對簇的分析，作者發現，相對於100％的水凝膠，10％的水凝膠表面定位的中位數顯著增加了232％，簇的數目增加了363％，簇的密度增加了363％（圖4e）。
圖4.整聯蛋白α5β1的dSTORM成像。
5.總結
為了探索多尺度接口測量之間的相關關係，作者在0和1之間建立了索引（圖5）。雖然該索引簡化了細胞與材料相互作用的複雜性，但它使細胞粘附和跨多個長度尺度遷移的各種細胞過程得以比較和組合。並排繪製這些索引值揭示了未結合事件和受體定位之間的明顯差異，這有助於解釋宏觀細胞遷移的觀察結果。在高結合（100％RGD）水凝膠上，hMSC和RGD之間的強相互作用（以更高數量的RGD-hMSC脫結合事件為例）說明了細胞對基底的穩定粘附和較慢的遷移。在低結合（10％RGD）水凝膠上，hMSC與水凝膠之間較少的特異性相互作用，如減少的RGD-hMSC未結合事件所示，與增加的α5β1表面定位和聚集相關，可能是細胞反應，試圖改善細胞黏附，導致更快的遷移。
圖5.多尺度接口參數的相關性。
參考文獻：
doi.org/10.1021/acsnano.0c07428
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