哈佛大學郭俊凌《生物大分子》膠原纖維仿生熱敏止血水凝膠

2021-01-08 Hydrogel

【背景介紹】

人體的自然止血可以通過止血技術的發展來增強，並且已經開發出許多止血材料，包括基於纖維蛋白的膠或密封劑，沸石粉末，交聯的明膠基質等。基於膠原的止血材料因其優異的生物相容性，低毒性和弱抗原性而被廣泛用於止血目的。這些天然存在的有利特性使基於膠原的材料成為控制出血的有前途的解決方案，市場上已經有多種商業產品可用。

當前，兩種通用方法用於製備基於膠原的水凝膠。由於膠原蛋白分子組裝體的無序結構，通過常規的反覆冷凍乾燥方法製備的膠原蛋白水凝膠通常易碎且柔韌性較低，強度低。當通過原位凝膠形成（膠原蛋白自聚集方法）形成凝膠時，這些材料在膠原分子的分散狀態中具有可逆的變化，導致從溶液到凝膠的相變。膠原蛋白的自聚集可引起基於膠原蛋白的水凝膠的熱響應特性。這對於促進傷口閉合和出血控制很重要。具體而言，液態能夠在傷口部位實現出色的可塑性和快速的相變，從而形成高親水性凝膠的3D網絡結構。相變過程可在生理溫度下發生，導致形成粘性凝膠並阻塞治療傷口的出血部位。

【摘要】

大量失血會導致無法控制的出血，從而帶來巨大的死亡風險。因此，當前的緊急止血處理（包括用紗布加壓或「被動」輸血）遠非理想，而最新開發的止血劑仍具有共同的局限性，而未考慮治療後的組織修復和抗菌活性。最近，陝西科技大學講師劉新華/副校長王學川攜手哈佛大學教授郭俊凌等研究人員介紹了一種新型的生物啟發的聚集的膠原蛋白納米纖維為基礎的生物相容性和高效止血水凝膠材料（TS-Gel-Ag-col），它是通過模擬粘液模擬的泊洛沙姆，聚乙烯吡咯烷酮和樹膠素/殼聚糖二醛協同交聯的聚集體的多功能化合物製備的膠原納米纖維裝飾有銀納米顆粒。水凝膠的表徵以及體外和體內研究表明，這些材料具有有效的抗出血和抗菌傷口保護作用。而且，TS-Gel-Ag-col可以通過促進血管再生來促進皮膚傷口的組織修復。對於下一代基於膠原的可吸收止血材料以及智能人造皮膚的開發具有廣闊的前景。相關論文Thermoresponsive Hemostatic Hydrogel with a Biomimetic Nanostructure Constructed from Aggregated Collagen Nanofibers發表在《Biomacromolecules》上。

洞察TS-Gel-Ag-Col凝膠成分之間的相互作用

TS-Gel-Ag-col組分之間的分子間相互作用可能對Ag-col的特定性質產生很大影響。圖1a顯示了基於生物啟發的聚集膠原蛋白納米纖維的生物相容性和高效止血水凝膠（TS-Gel-Ag-col）的製備方案。其中證實聚集蛋白由典型的D周期交叉條紋的膠原蛋白納米纖維和通過SEM和AFM分析獲得厚的膠原蛋白納米纖維束（圖1b）。TS-Gel-Ag-col在不同F-107劑量下的FT-IR光譜（圖1c）顯示膠原分子骨架中醯胺A，B，I，II和III譜帶的特徵吸收峰。不同F-107劑量下TS-Gel-Ag-col的XRD圖譜僅顯示F-107的衍射峰（圖1d）。與文獻相符，兩個強和尖銳的結晶峰分別出現在水平和垂直方向，分別代表F-107分子的重複單體結構，分別位於19°和23°。未觀察到Ag-col的無定形衍射峰，可能是因為F-107凝膠中的高濃度可能完全包裹了Ag-col的纖維表面。

圖1

微形貌和相變分析

臨界膠束溫度（CMT）是對溫度敏感的原位凝膠的重要性能。對於不同的F-107量（圖2a）和相應的微分曲線（圖2b），評估了彈性模量（G'）對TS-Gel-Ag-col對溫度（T）的依賴性。隨著F-107用量的增加，彈性模量有所提高。CMT隨著F-107的增加而降低（圖2）。在F-107濃度為15％，20％，25％和30％的條件下，TS-Gel-Ag-col的CMT分別為45°C，43°C，37°C和34°C。因此，當F-107劑量超過25％時，TS-Gel-Ag-col可在生理溫度下發生相變。通常，彈性模量越高，凝膠強度越強；反之，凝膠強度越強。實際上，增加F-107的濃度會增加凝膠強度。當F-107增加到25％時，TS-Gel-Ag-col彈性模量約為0.1 MPa，該值有利於傷口的快速癒合和二次出血的預防。

圖2

細胞相容性和抗菌性能的評估

考慮到促進傷口癒合所需的潮溼環境也有利於細菌和微生物的生長和繁殖，賦予水凝膠以抗菌/抑菌特性是主要的研究重點。在不同的F-107劑量下，TS-Gel-Ag-col對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌抑制區直徑的影響如圖3a所示。添加AgNPs後，TS-Gel-Ag-col對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌具有良好的抗菌/抑菌作用，其中F-107的量對TS-Ge l -Ag-col的抗菌/抑菌特性沒有顯著影響。此外，不含AgNPs的TS-Gel-Ag-col（對照組）也顯示出一定的抗菌/抑菌特性，證實了二醛殼聚糖可以賦予Ag-col以抗菌/抗菌特性，同時實現Ag-col的功能交聯。

圖3

體外和體內止血性能評估

圖4b顯示了在不同F-107劑量下TS-Gel-Ag-col的APTT，PT和TT，表明F-107含量對TS-Gel-Ag-col的APTT，PT和TT沒有影響，並進一步確認F-107不參與內源性和外源性凝血過程。如前所述，膠原蛋白的凝結過程高度依賴於凝結因子，因此無法在特殊血液疾病患者中發揮止血作用。不過，在TS-Gel-Ag-col中，OCS可以進行間接止血，而不受人體凝血因子的影響，並且不參與傳統的「瀑布」模型止血過程。PVP主要起親水作用，對生理凝血過程沒有影響。F-107主要通過相變來止血，形成阻止傷口出血的凝膠，即物理止血，因此其作用與凝血因子的激活無關。因此，TS-Gel-Ag-col中膠原蛋白與F-107和PVP的結合降低了止血對凝血因子的依賴性。總CT可以反映出TS-Gel-Ag-col在體外的凝血作用（圖4a）。隨著F-107含量的增加， CT表現出明顯的下降趨勢，尤其是在25％以上時。這可能是因為溫度達到37°C時結合膠凝時間分析，TS-Gel-Ag-col可以快速形成凝膠相轉變3D網絡凝膠結構為血小板粘附和聚集提供了豐富的空間，從而導致CT顯著降低。因此，F-107的物理止血作用在TS-Gel-Ag-col的止血特性中起著重要作用，高濃度的凝膠能夠在凝結的初始階段迅速改變並阻止血液流動。通過SEM觀察到凝結後凝塊的微觀結構（圖4c）。血細胞，尤其是血小板聚集在TS-Gel-Ag-col表面或網絡中，並與凝膠緊密相連，表明血細胞可以在其表面培養，並允許內部粘附和聚集，對於形成血栓形成至關重要。此外，綜合利用三種類型的創傷性出血模型（大鼠肌肉創傷，肝臟和兔耳動脈損傷）來評估體內的止血性能（圖4d）。結果清楚地表明，與商業Helitene膠原止血材料相比，TS-Gel-Ag-col止血速度明顯更快。

圖4

組織病理學觀察

通過HE和Masson染色在不同時間間隔對TS-Gel-Ag-col-，TS-Gel-Col-和凡士林紗布處理的傷口進行組織學觀察（圖5）。術後1周在傷口中觀察到不同程度的炎症反應。然而，TS-Gel-Ag-col和TS-Gel-Col組均顯示出極少的炎症，而空白組（凡士林紗布）顯示出強烈的炎症，大量的炎症細胞聚集在傷口癒合部位，炎性細胞浸潤。術後2周，TS-Gel-Ag-col和TS-Gel-Col組的炎性細胞浸潤明顯減少，傷口的真皮層基本得到修復。此外，基底細胞排列整齊並觀察到更多小血管的存在。值得一提的是，TS-Gel-Ag-col組的表皮層甚至表現出基本修復的完整性，並且新生膠原纖維的編織更為緊密。最後，在術後3周，TS-Gel-Ag-col和TS-Gel-Col組的皮膚結構已完整形成，基底細胞呈單層緊密排列，真皮中成纖維細胞數量增加。幸運的是，在TS-Gel-Ag-col組中，新的皮膚表皮較厚，真皮膠原纖維水平排列，且編織方式緊密。總體而言，TS-Gel-Ag-col和TS-Gel-Col都能促進組織的傷口癒合，前者的作用更為明顯。聚合Col可以促進成纖維細胞和血管內皮細胞的生長和增殖，從而加快傷口修復。

圖5

【結論】

以二醛殼聚糖為還原劑和穩定劑，用AgNPs製備了一種利用F-107熱反向凝膠化特性的新型基於膠原納米纖維聚集體的原位多功能凝膠。結果表明，TS-Gel-Ag-Col中的PVP，F-107和Ag-Col通過物理分子間氫鍵鍵合。新形成的氫鍵網絡改善了TS-Gel-Ag-Col的熱穩定性。同時，用25％F-107製備的TS-Gel-Ag-Col在20 s的人體生理溫度下能夠完成從溶液到凝膠的相變，通過形成物理屏障發揮出色的止血作用。材料的相應彈性模量達到約0.1MPa，因此能夠有效地防止凝膠在與血液接觸時被稀釋或洗掉。 TS-Gel-Ag-Col展示了具有相互連接的空腔的3D多孔網絡結構和具有縱向間隙的分層3D結構。而且，AgNP均勻地分散在凝膠的表面和內部，平均粒徑為60nm。細胞相容性，抗菌/抑菌性能和體外凝血性能的結果表明，濃度為5 ppm的AgNPs的TS-Gel-Ag-Col具有優異的生物相容性和抗菌/抑菌活性。將F-107的濃度調整為25％時，TS-Gel-Ag-Col的體外總凝結時間約為20 s。最重要的是，體內動物實驗表明，相對於TS-Gel-Col，TS-Gel-Ag-Col更好地促進了皮膚傷口組織的再生和修復。總之，TS-Gel-Ag-Col有潛力成為新一代基於膠原的可吸收止血生物材料，而Ag-col可以作為當前常規膠原材料的更好替代來源，用於進一步的生物醫學甚至人工合成皮膚材料的應用。

參考文獻：doi.org/10.1021/acs.biomac.0c01167

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