西湖學者萬蕊雪和西湖大學博士後白蕊等Science發文,報導剪接體...

2020-12-14 中國生物技術網

北京時間11月27日，西湖大學生命科學學院施一公教授研究組就剪接體的機理與結構研究，於《科學》（Science）雜誌以長文形式再次發表研究成果（圖1）。

論文連結：

https://science.sciencemag.org/content/early/2020/11/24/science.abe8863

圖1 論文截圖

這篇題為《ATP水解酶/解旋酶Prp2及其激活因子Spp2催化剪接體激活過程中結構重塑的分子機理》（Mechanism of Spliceosome Remodeling by the ATPase/helicase Prp2 and its Coactivator Spp2）的論文報導了釀酒酵母處於激活狀態的剪接體（activated spliceosome，定義為「Bact複合物」）2.5埃的高解析度電鏡結構，此外還解析了ATP水解酶/解旋酶Prp2處於游離狀態以及Prp2與其激活因子Spp2複合物的電鏡結構。

該結構是目前報導的最高解析度的剪接體結構，首次展示了剪接體狀態轉變過程中的「動力驅動」蛋白——ATP水解酶/解旋酶Prp2及其激活因子Spp2催化其重塑的結構基礎，並結合大量生化實驗，闡明了Prp2在前體信使RNA上單向移動的分子機理，回答了Spp2如何通過將Prp2錨定在剪接體上輔助其發揮重塑剪接體的功能等一系列重要科學問題。

1977年，科學家們首次發現來自於腺病毒的mRNA與其對應的DNA轉錄模板並不能形成連續的雜交雙鏈，而是在雜交雙鏈的不同位置伸出了環狀的DNA單鏈。這個重大發現表明，遺傳信息從DNA傳遞到mRNA上並不只是通過轉錄，還需要pre-mRNA剪接來進一步完成「無效」遺傳信息的去除與有效遺傳信息的拼接。不能被翻譯的「無效」RNA片段被稱為內含子，而可以被核糖體翻譯的RNA片段叫做外顯子，內含子被去除、外顯子被連接這一過程即為RNA剪接。RNA剪接普遍存在於真核生物中，隨著物種的進化，含有內含子的基因數量增加，發生RNA剪接的頻率也相應增高，使得一個基因編碼多個蛋白質成為可能，極大的豐富了蛋白質組的多樣性，也是真核生物多樣性的重要原因之一。

RNA剪接是真核生物基因表達調控的重要環節之一，其化學本質是兩步轉酯反應。這種看似簡單的化學反應在細胞中難以自行發生，而負責執行這一化學反應的是細胞核內一個巨大且高度動態變化的分子機器——剪接體（spliceosome）。

從1977年首次發現RNA剪接至本世紀初，科學家們通過免疫沉澱、基因敲除、交聯質譜、建立體外剪接反應系統等研究手段，初步建立起剪接體的組裝、激活與解聚的發生過程，以及蛋白與蛋白、蛋白與核酸之間的相互作用、相互調控等複雜的RNA剪接調控網絡。在RNA剪接反應過程中，多種蛋白-核酸複合物及剪接因子按照高度精確的順序發生結合、重排和解聚，依次形成預組裝複合物U4/U6.U5 tri-snRNP（U4/U6.U5三小核核糖核蛋白複合物）以及至少10個狀態的剪接體E、A、pre-B、B、Bact、B*、C、C*、P以及ILS複合物。剪接體每種狀態的轉變，都需要動力驅動蛋白——ATPase/helicase對剪接體的結構重塑進行嚴格的調控（圖2），它們在催化剪接體構象的改變、控制RNA剪接的進程、對RNA進行檢驗和校對等過程中有著極其關鍵的作用，被譽為RNA剪接的「分子時鐘」。

圖2 RNA剪接示意圖

圖片來源: Yan, C., Wan, R., & Shi, Y. (2019).

Cold Spring Harbor perspectives in biology, 11(1), a032409.

由於剪接體高度的動態性和複雜性，獲得不同狀態的剪接體的高解析度三維結構被公認為世界難題。在這種巨大的挑戰下，研究組迎難而上，經過7年的努力，終於在2015年在全世界首次報導了裂殖酵母剪接體3.6埃的高解析度結構，首次展示了剪接體催化中心近原子解析度的結構。這一重大研究成果對RNA剪接機理的研究產生革命性影響。

自2015年第一個剪接體結構發表以後，施一公研究組相繼解析了釀酒酵母剪接體複合物全部已被鑑定的9個不同狀態的高解析度結構，分別是3.8埃的預組裝複合物U4/U6.U5 Tri-snRNP、3.3埃-4.6埃的預催化剪接體前體pre-B complex、3.9埃的預催化剪接體B complex、3.5埃的激活狀態剪接體Bactcomplex、2.9埃-3.8埃的催化激活剪接體B*complex、3.4埃的第一步催化反應後剪接體C complex、4.0埃的第二步催化激活剪接體C* complex、3.6埃的完成兩步轉酯反應後的剪接體P complex，以及3.5埃的內含子套索剪接體ILS complex的結構。

這些已解析的剪接體覆蓋了RNA剪接循環，從分子層面揭示了剪接體催化RNA剪接兩步反應的工作機理，同時為理解剪接體的組裝、激活和解聚等過程的發生提供結構依據。然而，在每種狀態的剪接體結構中，「動力源」蛋白ATPase/helicase均處於剪接體的邊緣，它們的構象極不穩定，因此無法揭示「分子時鐘」精確的原子模型。如何闡述剪接體重塑蛋白控制剪接體狀態轉變的分子機理，一直是領域內的核心難題之一。

在最新發表的這篇《科學》文章中，該研究組以激活剪接體的結構重塑蛋白Prp2為切入點，巧妙地設計了Prp2的突變體，使其失去結合ATP的功能，成功的將RNA剪接阻斷並富集了大量的激活狀態剪接體Bactcomplex；失活的Prp2也更加穩定地結合在剪接體上，從而最終獲得了構象穩定、性質良好的Bactcomplex樣品。隨後利用單顆粒冷凍電鏡技術重構出了整體解析度為2.5埃的Bactcomplex冷凍電鏡結構，其中，處於剪接體邊緣的結構重塑蛋白ATPase/helicase Prp2與其激活因子Spp2的解析度高達3.2埃，並搭建了原子模型（圖3）。

圖3 釀酒酵母激活剪接體及結構重塑蛋白Prp2的三維結構

在如此高的解析度下，該文解析的Bactcomplex結構首次觀察到了剪接體核心區域中的水分子通過氫鍵參與關鍵剪接位點的識別、以及與金屬離子的配位結合。令人驚喜的是，該結構展示了激活因子Spp2通過四個關鍵的錨定位點，將Prp2固定到剪接體上。Spp2對於Prp2激活剪接體、催化剪接體結構重塑的重要作用也被基於結構設計的大量生化實驗驗證。本文另一亮點是通過分析Prp2結合前體信使RNA的相互作用界面，並結合體外剪接反應等生化實驗、以及所解析的3個不同狀態的Prp2電鏡結構，第一次揭示了Prp2作為ATPase/helicase在單鏈RNA上單向移動的分子機理。其中，兩個關鍵的胺基酸L536和R844在阻止RNA反向滑動中起到了至關重要的作用，保證Prp2在前體信使RNA上由3』向5』方向移動，從而將分支點區域的蛋白複合物從剪接體上解離下來，促使剪接體發生結構重塑進而發生第一步剪接反應（圖4）。

圖4 結構重塑蛋白Prp2及其激活因子Spp2的三維結構

此前，該研究組解析了已被鑑定的酵母中全部狀態的剪接體高分辨三維結構，而本文作為第一篇剪接體重塑機制的結構研究，首次揭示了位於剪接體原位的ATPase/helicase高解析度的三維結構，為理解剪接體激活重塑的分子機理提供了迄今最清晰的結構信息。

西湖大學生命科學學院施一公教授、西湖大學生命科學學院西湖學者萬蕊雪博士為本文的共同通訊作者；西湖大學生命科學學院博士後白蕊、西湖學者萬蕊雪和清華大學生命科學學院助理教授閆創業為該文的共同第一作者，清華大學生命科學學院博士生賈麒參與了部分生化實驗；清華大學冷凍電鏡平臺主管雷建林博士為冷凍電鏡數據收集提供了幫助。電鏡數據採集於清華大學冷凍電鏡平臺，計算工作得到清華大學高性能計算平臺、國家蛋白質設施實驗技術中心（北京）的支持。本工作獲得了西湖教育基金會、北京結構生物學高精尖創新中心（清華）及國家自然科學基金委的經費支持。

相關論文連結：

http://science.sciencemag.org/content/early/2016/01/06/science.aad6466

http://science.sciencemag.org/content/early/2015/08/19/science.aac8159

http://science.sciencemag.org/content/early/2015/08/19/science.aac7629

http://science.sciencemag.org/content/early/2016/07/20/science.aag0291

http://science.sciencemag.org/content/early/2016/07/20/science.aag2235

http://science.sciencemag.org/content/early/2016/12/14/science.aak9979.full

http://www.cell.com/cell/fulltext/S0092-8674(17)30954-6

http://www.cell.com/cell/fulltext/S0092-8674(17)31264-3

http://science.sciencemag.org/content/early/2018/05/23/science.aau0325

https://www.cell.com/cell/fulltext/S0092-8674(19)30155-2

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