上海交大研究團隊與合作者揭示細菌P450催化吡咯並吲哚骨架的立體...

2020-12-14 上海交通大學新聞網

近日，國際權威期刊《Nature Communications》在線發表了上海交通大學生命科學技術學院瞿旭東教授與澳大利亞昆士蘭大學賈新穎博士及Bostjan Kobe教授的合作成果「Molecular Basis of Regio- and Stereo-Specificity in Biosynthesis of Bacterial Heterodimeric Diketopiperazines」，該工作是瞿旭東教授課題組在吡咯並吲哚骨架生物合成領域取得的又一重要突破。瞿旭東教授、昆士蘭大學賈新穎博士和Bostjan Kobe教授為論文的共同通訊作者，上海交通大學生命科學技術學院博士後孫成海和昆士蘭大學博士後羅震遙為本文的共同第一作者。

細菌來源的異源二聚化吡咯並吲哚類生物鹼是一類複雜且生物活性多樣的重要的天然產物。由於該類生物鹼核心結構中有兩個連續的叔碳和季碳手性中心，使得化學合成極具難度，目前尚未有統一高效的化學合成方法實現該類生物鹼的高效快速合成及結構拓展。為解決這一瓶頸問題，瞿旭東教授課題組另闢蹊徑，採用生物學方法在該類生物鹼的生物合成領域取得了一系列成果。

此前，在研究海洋鏈黴菌Streptomyces sp. CMB-MQ030來源的異源二聚化產物NAS-C的生物合成過程中，瞿旭東教授團隊發現了關鍵P450酶NascB，通過自由基介導的串聯反應，NascB可催化兩分子的含色氨酸的環二肽（cW-X）以不同方式進行異源二聚，同時該酶具有非常廣泛的底物譜，通過餵養化學合成的20種cW-Xs，成功創造出了30種具有不同區域/立體選擇性的異源二聚化產物。相關研究同樣已發表在《Nature Communications》上（2018, 9, 4428. DOI: 10.1038/s41467-018-06528-z）。

在NascB這一關鍵P450被發現後，國外一些研究團隊進行了多項基因組挖掘研究，相繼又發現了多個不同P450酶，其可分別催化環二肽底物產生五種具有不同區域/立體選擇性的異源二聚化產物；而解決這些發現背後的更深層次的科學問題，即P450酶如何調控反應過程中的區域/立體選擇性，則是本項目的研究目標。

該項研究首先通過基因組挖掘及蛋白功能鑑定發掘三個與NascB高度同源的三個P450酶（NasbB，NasS1868 and NasF5053），其中NasS1868 可催化產生異源二聚化產物ASP-A，而NasF5053可以同時產生ASP-A, NAS-B和NAS-C。比對NascB、NasS1868 和 NasF5053的胺基酸序列發現，NasF5053的前112個胺基酸與NascB完全一致，NasF5053剩餘的後半段與NasS1868幾乎完全一致，說明NasF5053前112個胺基酸中存在調控NAS-C生成的關鍵位點，而其後半段存在調控生成ASP-A的關鍵位點，為此通過一系列的嵌段突變及單點突變研究，成功發現四個胺基酸位點Q65, A86及S284, V288對環二肽底物的異源二聚化方式存在重要調控作用；突變體NasF5053-Q65I+A86G只產生NAS-C，而NasF5053- S284A+V288A只產生NAS-C。同時，通過對這四個位點進行飽和突變研究，NasF5053- A86K+V288P突變體可催化cW-P底物產生新的異源二聚化產物NAS-E，進一步證實這四個關鍵胺基酸位點控制了反應的區域和立體選擇性。 

為深入理解NasF5053催化過程中的分子基礎，本項目昆士蘭大學合作方解析了NasF5053，NasF5053-Q65I+A86G及NasF5053- S284A+V288A的底物複合物晶體結構，發現三者的活性口袋中均有兩分子的底物cW-P，其中一分子底物處於彎曲狀態，有利於生成吡咯並吲哚稠環核心骨架，並進攻另一分子處於相對舒展狀態的底物生成最終產物，但僅通過這些晶體結構並不能解釋為什麼NasF5053能夠產生不同的產物。為此，本研究進一步採用分子動力學模擬的方法，通過比對NasF5053與NasF5053-Q65I+A86G、NasF5053- S284A+V288A及NasF5053- A86K+V288P的動力學結果，發現Q65-A86兩個位點突變後，αB』-αC Loop發生位移，使得彎曲底物的N10和C2之間距離變大，難以生成NAS-C；而S284-V288兩個位點突變後，舒展底物周圍的空間變大，舒展底物移向heme活性中心，導致其對彎曲底物的束縛能力降低，彎曲底物移向αI螺旋，剛性隨之變強，N10和C2之間距離變小，只能生成NAS-C。此外，通過統計比對C2-C3-C12-N10形成的二面角，發現NasF5053- S284A+V288A中二面角主要為負值，利於生成NAS-C構型；而NasF5053- A86K+V288P中為正值，利於NAS-E的生成。晶體結構學和分子動力學結合，清晰地解釋了P450酶在催化環二肽底物二聚過程中的調控機制。

這項工作系統深入的解析了細菌P450催化環二肽底物區域/立體選擇性二聚的分子基礎，為後期酶工程改造及實現吡咯並吲哚類生物鹼的高效快速合成奠定了堅實基礎。

該項目的研究工作受到了國家自然科學基金，上海市超級博士後項目以及國家重點研發項目的支持。

論文連結：https://rdcu.be/cbNU4

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