從Dactylia sp.nov海綿的提取物中分離出7種新的芳基吡咯生物鹼（1-7）以及4種已知化合物，並通過NMR和MS光譜數據闡明了它們的結構。Denigrins D–G（1–4）在其核心結構中具有高度取代的吡咯或吡咯酮環，而dactylpyrroles A–C（5–7）具有三環菲核。由於這些骨架具有質子缺陷性質，1H-15N HMBC和LR-HSQMBC NMR實驗的關鍵雜核相關性被用於脫氮菌素D（1）的結構分配。Dictyodendrin F（8），一種共代謝物，能夠抑制由致癌PAX3-FOXO1融合基因驅動的轉錄，IC50值為13μM。
得到Denigrin D（1），為黃色無定形固體，（+）-HRESIMS光譜在m/z600.2395處顯示質子化分子[M+H]+，對應於分子式為C38H33NO6，不飽和度為23。紅外光譜顯示出對羥基（3311cm-1）和羰基（1671cm-1）基團的強吸收。1HNMR光譜最初是在CD3OD中獲得的，但在芳香區δH6.00–7.50中有明顯的信號重疊。吡啶-d5（表1）中的1HNMR數據更分散，並且它們顯示四個亞甲基（δH2.64,3.12,3.46（2H），3.67,3.89,4.17,4.26）和五對2H雙峰的信號，由五個對位取代的苯基團（δH6.79,7.03,7.09,7.13,7.15,7.27,7.31,7.35,7.41,7.73）。組合的13CNMR和HSQC數據（表2）證實存在38個碳，包括一個羰基（δC181.7），12個非質子化的sp2碳（δC123.4，126.4，128.0，128.5，130.3，132.6，138.3，158.1，158.33，158.5，158.8），10個簡併sp2次甲基（δC116.3，116.8，117.2，117.4，129.3，130.2，130.3，131.1，132.8）分別反映了兩個芳香碳，一個非質子化sp3碳（δC61.8），和四個亞甲基碳（δC31.3,35.3,38.8,44.1）。根據特徵性的13C化學位移，COSY耦合和HMBC相關性推導出構成環A–E的五個對苯酚基團（圖1）。H-6（δH3.46,3.89）和C-6（δC44.1）的去屏蔽化學位移，從H-6到H-7的COSY相關性以及H-9/C-7的HMBC相關性表明A環是酪胺部分的一部分。H-6/C-2和H-6/C-5的HBMC相關性表明三個C–N鍵將C-2，C-5和C-6與N-1連接在一起。H-16/C-14與H-14/C-15和C-16之間的HMBC相關性有助於建立對羥基苄基，其基於H-14/C-5之間的HMBC相關性連接在C-5上。H-14/N-1（δN148.0）的1H-15N HMBC為該分配提供了進一步的支持。H-14在HMBC譜中顯示出與C-4的額外相關性，揭示了C-4和C-5之間的聯繫。H-22/C-4之間的HMBC相關性確定了環C的位置。根據H-35/C-33和H-33/C-34和C-35的HMBC相關性，環E是另一個對羥基苄基取代基的一部分。C-35。H-33/C-2，C-3和C-4的HMBC相關性有助於定義C-2，C-3和C-4之間的聯繫以及C-33與C-3的聯繫。最後，環D通過H-28/C-3的HMBC相關性在C-3處連接。儘管這些條件可以提出1的結構，但中心吡咯酮環周圍的大多數芳基取代的位置基於單個HMBC相關性。因此，作者進行了最近報導的LR-HSQMBCNMR實驗，以檢測另外的四鍵和五鍵長程C-H偶聯。H-14/C-21和27，H-22/C-5，H-28/C-2和C-4以及H-35/C-3的LR-HSQMBC相關性（針對nJC，H=2Hz優化）為芳基取代基的位置提供了進一步的證據（圖1）。
Denigrin D（1）樣品在ECD光譜中未顯示任何cotton effect（考頓效應），但它的確在鈉D波長處提供了可測量的負旋光度（OR），因此可以嘗試分配C-3的絕對構型。然而，DFT計算的五種不同波長（365，405，436，546，589和633nm）的OR值與這些波長下的實驗OR測量值的相關性較差，因此無法得出關於立體中心構型的結論。實驗和DFT計算的VCD光譜的比較也是不確定的。無法將DFT計算出的物理性質（如OR和VCD）與實驗測量緊密關聯，這表明樣品可能不是純的對映體。因此，denigrin D在多個手性固定相中進行手性相超臨界流體色譜（SFC）篩選，顯示它由對映體混合物組成（圖2）。在Chiralpak IC-3手性固定相上實現了denigrin D對映體的手性拆分，該固定相基於峰面積（≈1:1）將其確定為外消旋混合物。
得到Denigrin E（2），為品紅色無定形固體，基於C38H33NO5的（+）-HRESIMS的分子式具有比1少一個氧原子。紅外光譜顯示羥基有很強的吸收帶（3343 cm-1），並且沒有羰基吸收。2的1H NMR（表1）和HSQC光譜僅顯示出數量有限的信號，包括亞甲基質子的三個信號（δH2.79,4.01,4.34）和六個芳族信號（δH7.07,7.13,7.16,7.17,7.40,7.63）。從最強屏蔽到不屏蔽的1H信號的仔細積分分別顯示出1:1:2:1:1:2:2:2:2的比率，表明2的對稱結構。COSY和HMBC相關性（圖3）證實了酪胺單元，為兩個對羥基苄基單元和兩個與吡咯核連接的對羥基苯基單元。H-16/C-5（H-35/C-2）的HMBC相關性顯示對羥基苄基在C-2和C-5處被取代，而H-22/C-4（H-28/C-3）在C-3和C-4處建立對羥基苯基。
將Denigrin F（3）純化為深黃色無定形固體，並在（+）-HRESIMS光譜中在m/z 494.1952處得到質子化分子[M+H]+，其建立了不飽和度為19的C31H27NO5分子式。IR分析證實存在羥基（3268 cm–1）和羰基（1655 cm–1）。NMR信號對應於八個芳族雙峰，每個芳族雙峰各自整合兩個質子（δH/δC6.57/115.5,6.60/131.5,6.68/116.2,6.68/117.0,6.73/116.4,6.86/131.8,6.94/131.5,6.94/131.5和6.68/117.0,6.73/116.4,6.73/116.4,6.86/131.8,6.94/131.5和6.02/131.5和7.02/130.8和7.02/130.8），一個去屏蔽的sp3次甲基（δH/δC4.52/63.63.5），三個亞甲基（δH/δc2.60和3.03/36.1，2.76和2.87/34.7，3.37和4.05/44.3），10種非質子化sp2碳（δC 124.0、124.4、127.1、131.1、131.5、153.7、157.3（2C）、158.5、161.5），在1H和13C光譜中觀察到羰基碳（δc173.6）（表1和表2）。在1D和2D NMR分析之後，建立N，N-二取代的酪胺部分，其中C-2羰基和C-5次甲基連接到N原子，兩個另外的對羥基苯基和對羥基苄基取代基（圖3）。從H-5到C-2、C-3和C-4的HMBC相關性揭示了吡咯酮結構，而H-5/H-14和H-5/C-15、H-22/C-4和H-28/C-3的HMBC相關性的關鍵COSY相關性確定了芳基取代基的位置。Denigrin F（3）具有光學活性，但在ECD光譜中未顯示考頓效應。其DFT計算的五種不同波長的OR值與實驗OR測量值沒有很好的相關性，這表明它也由對映體混合物組成。
Denigrin G（4）被分離為橙色無定形固體，其分子式為C31H27NO6，通過（+）-HRESIMS測量確定。4的1H和13C NMR光譜（表1和2）顯示出與3相似的信號，除了3中N-取代的次甲基的消失和未質子化但氧取代的碳（δC94.7）在4出現。根據NMR分析及其分子式，提出denigrin G（4）與3具有相同的結構，但在C-5位具有羥基取代基（圖3）。Denigrin G（4）是外消旋的，因為它是光學無活性的，並且在ECD光譜中沒有測量出考頓效應。
將Dactylpyrrole A（5）純化為黃色無定形固體，並且其分子式在（+）-HRESIMS光譜中以m/z 508.1763從質子化分子[M+H]+推導出為C31H25NO6。在340 nm（MeOH）處的最大紫外吸收顯示5的延長共軛，在3311和1680 cm-1處的IR譜表明存在羥基和羰基。與denigrins D-G（1-4）不同，dactylpyrrole A（5）顯示兩個ABX芳族體系的信號[δH7.12（dd，J=8.8,2.4Hz），7.34（dd，J=8.8,2.4Hz），7.92（d，J=2.4 Hz），8.02（d，J=2.4 Hz），8.50（d，J=8.8 Hz），8.84（d，J=8.8 Hz）]（表1），除了兩個對位取代的苯基[δH6.21,6.25,6.78,7.22（各2H）]和三個亞甲基（δH2.93,3.08,3.51,3.62（2H），3.85）。5的13C NMR數據（表2）與4的差不多，表明它們的結構顯著相似。H-6/C-2和C-5，H-14/C-5，H-22/C-4和H-32/C-3的HMBC相關性說明5與4相關（圖4）。從H-25到C-28以及H-29到C-26的其他HMBC相關性揭示了C-26和C-28之間的聯繫，從而形成了由環C-E組成的菲體系。Dactylpyrrole A（5）具有光學活性但在ECD光譜中沒有顯示出棉花效應，其實驗OR值與DFT計算的ORs值沒有很好的相關性，因此它最有可能是對映體的混合物。
得到Dactylpyrrole B（6），為無定形黃色固體。通過（+）-HRESIMS與[M+H]+質子化分子在m/z 522.1917處建立分子式C32H27NO6。1H NMR譜（表1）實際上與5相同，但在δH2.97處存在甲氧基。6的13C數據也與5的13C數據密切相關。甲氧基的位置根據其與C-5的HMBC相關性而放在C-5（圖4）。Dactylpyrrole B（6）是光學無活性的，它可能是通過化合物5與甲醇的酸催化反應在提取物分餾過程中形成的偽影。
分離出Dactylpyrrole C（7），為黃色無定形固體，通過（+）-HRESIMS分析推導出其分子式C31H23NO5。根據其1H和13C NMR數據（表1和2），Dactylpyrrole C（7）在結構上與5和6相關，但7在C-5以及C-14亞甲基上缺少羥基或甲氧基取代。它們被δC136.7（C-5）的非質子化烯烴碳和δH/δC7.53/116.6（C-14）的sp2次甲基取代。這表明存在Δ5,14雙鍵，這可通過從H-14到C-16和C-4以及從H-6到C-5的HMBC相關性進一步證實（圖4）。雖然由於7的不穩定性，雙鍵的構型不能直接確定，根據denigrin B中E烯烴的類似1H和13C NMR化學位移，提出為B。denigrin B的環C和D之間假設的芳基-芳基分子內偶聯可導致C-26和C-28之間的連接，從而提供dactylpyrrole C（7）。
還從Dactylia sp提取物中分離出已知化合物dictyodendrin F（8），denigrin A， denigrin B，和spirodactylone，並通過光譜數據比較（NMR，MS，和旋光率）與文獻值匹配。化合物1-8以及denigrins A和B以及螺十二烷酮在螢光素酶報告基因測定中進行了測試，該測定用於鑑定PAX3-FOXO1易位誘導的基因轉錄的抑制劑。只有dictyodendrin F（8）表現出對PAX3-FOXO1驅動的螢光素酶表達的中度且具有選擇性抑制，IC50值為13（±3）μM（圖5）。它在濃度≥20μM時表現出非特異性細胞毒活性。放線菌素D是該測定中的陽性對照，IC50為1.0nM。在這種類型的PAX3-FOXO1測定系統中顯示出活性的其他天然產物包括環狀四肽1-丙氨酸衣原體和毒胡蘿蔔內酯，一種高度官能化的倍半萜內酯。雖然8的效力和選擇性適中，但這些初步的SAR結果表明，進一步探索芳基吡咯作為潛在的PAX3-FOX1抑制劑應該集中於製備dictyodendrin F的取代吲哚-2,6-二酮核心。
本文於2020年11月5日在線發表於：《Journal of Natural Products》，第一作者為Unwoo Kang，通訊作者為：Kirk R. Gustafson，通訊單位是美國國家癌症研究所癌症研究中心。
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https://pubs.acs.org/doi/10.1021/acs.jnatprod.0c01103