2020年7月27日及10月9日，北京大學生命科學學院高寧研究組與卡耐基梅隆大學的 John L. Woolford Jr. 研究組合作在Nature Communications雜誌分別發表題為 「Coupling of 5S RNP rotation with maturation of functional centers during large ribosomal subunit assembly」 和 「Structural insights into assembly of the ribosomal nascent polypeptide exit tunnel」 的研究論文，報導了真核核糖體大亞基在細胞核中的多個高分辨的前體結構，揭示了核糖體大亞基功能中心在細胞核內的組裝機制以及它們之間的關聯。
真核核糖體的組裝是一個極其複雜又高度分級的過程，涉及核糖體 RNA（rRNA）的轉錄，修飾，加工和摺疊以及核糖體蛋白質的結合。在高等真核生物中，有超過300種因子參與核糖體的組裝，從而保證核糖體的生成準確而高效地進行。核糖體的組裝與細胞的生長、增殖和分化密切相關，研究表明人類細胞中參與核糖體組裝過程的蛋白發生突變會導致組織特異性缺陷的人類疾病，統稱為核糖體病變（ribosomopathy）。例如先天性再生障礙性貧血症（DBA, Diamond-Blackfan anemia）臨床表現為貧血、低網織紅細胞計數、巨紅細胞以及胎兒血紅蛋白表達增加和腺苷脫氨酶活性升高，是由於多種編碼核糖體蛋白的基因突變所造成的，包括RPS19、RPL5和RPL11等。此外，當核糖體組裝出現錯誤時，游離的5S RNP（CP 的組成部分）會與腫瘤抑制因子p53的抑制子MDM2結合，並將其隔離在核仁中，導致p53激活，細胞周期停滯並最終導致細胞凋亡。
得益於冷凍電鏡技術的發展，以酵母為模式生物，真核核糖體前體的多個不同狀態的高分辨結構獲得了解析。儘管擁有如此豐富的結構信息，但是領域對於核糖體的重要功能中心的組裝以及它們之間在組裝時是否存在偶聯還知之甚少，此外對於大部分組裝因子的具體分子功能尚待探索。核糖體大亞基的功能模塊包括中央凸起（CP, central protuberance）、肽基轉移酶中心（PTC, peptidyl transferase center）以及新生肽鏈出口隧道（NPET, nascent polypeptide exit tunnel），這些功能中心在進化上是高度保守的。真核核糖體大亞基的前體從核仁到核質的組裝過程中，結構會發生一些列的重大重組，其中包括組成CP的 5S RNP 的旋轉、組成PTC的 rRNA螺旋H68-71的構象轉換，以及組裝因子 Nog1的C端探入並結合NPET。
本研究結合分子遺傳學，生物化學以及冷凍電鏡技術深入的研究了與CP PTC、NPET 組裝相關的組裝因子的功能，包括Rpf2、Sda1、Nog1以及核糖體蛋白uL4。通過一個組裝因子 Nog2 作為誘餌，在其 C 端加入親和標籤，從 rpf2△255-344突變體、Sda1-depletion 突變體、rpl4Δ63-87突變體以及 nog1Δ595-647 rei1Δ341-393 reh1Δ380-432三突變體中親和純化出多個細胞核時期的大亞基前體的內源複合物。進一步通過定量質譜和冷凍電鏡表徵了這些前體複合物的組成和結構。實驗結果表明，早期RNA構象成熟可以作為結構檢查點，指導組裝進入下一個步驟，例如Rpf2 CTD的缺失會使得rRNA螺旋 H68-70處於不正常的中間狀態，從而進一步影響了5S RNP 的旋轉以及 PTC 和 NPET 的組裝。作者提出 Rpf2-Rrs1 複合體穩定錨定到核糖體大亞基前體，幫助 H68-70 的正確摺疊是核糖體大亞基組裝過程中的一個關鍵質量控制檢驗點。在針對NPET組裝相關的Nog1和uL4的突變株研究中，作者發現 NPET 的組裝與 5S RNP 的旋轉是通過 H74 相互偶聯的，H74 接收NPET組裝缺陷的信號並阻止CP區域的進一步成熟，並且通道結合蛋白uL4的突變會產生一系列的處於不同組裝階段的缺陷前體（很可能是turnover的中間體），表明NPET的組裝是前體核內成熟中的一個重要質量檢查點。
本項工作揭示了真核核糖體前體是如何感知 PTC 以及 NPET 的組裝缺陷並將其傳遞給其它區域，以及大亞基功能中心的組裝是如何關聯並相互影響的，為深入理解核糖體大亞基的組裝過程提供了重要的結構線索。
圖一、真核核糖體大亞基功能中心（CP）的組裝步驟。
北京大學生命科學學院高寧教授和卡耐基梅隆大學的 John L. Woolford Jr.教授為這兩篇文章的共同通訊作者，高寧實驗室 2015 級博士研究生李餘為兩篇論文的共同第一作者。該系列課題受到國家自然科學基金委員會、科技部和美國國立衛生研究院的項目資助，以及北京大學冷凍電鏡平臺、高性能計算中心、生命科學聯合中心、生科院儀器中心、膜生物學國家重點實驗室的支持。