Primer-BLAST:NCBI 的引物設計和特異性檢驗工具 分析技能

Primer-BLAST，在線設計用於聚合酶鏈反應（ PCR）的特異性寡核苷酸引物。 Primer-Blast 可以直接從 Blast 主頁（ http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/）找到，或是直接用下面的連結進入：http://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/這個工具整合了目前流行的 Primer軟體（一種引物設計軟體），再加上NCBI的 Blast進行引物特異性的驗證。Primer-BLAST免除了用另一個站點或工具設計引物的步驟，設計好的引物程序直接用 Blast 進行引物特異性驗證。並且，Primer-BLAST 能設計出只擴增某一特定剪接變異體基因的引物。 Primer-BLAST 有許多改進的功能，這樣在選擇引物方面比單個的用Primer 和 NCBI BLAST 更加準確。

Primer-BLAST 界面包括了 Primer 和 BLAST 的功能。提交的界面主要包括三個部分： target template（模板區） , the primers（引物區） , 和 specificity check（特異性驗證區）。跟其它的 BLAST一樣，點擊底部的「 Advanced parameters」有更多的參數設置。

在「 PCR Template」下面的文本框，輸入目標模板的序列， FASTA 格式或直接用 Accession Number。如果你在這裡輸入了序列，是用於引物的設計。 Primer-BLAST 就會根據你輸入的序列設計特異性引物，並且在目標資料庫（在 specificity check 區選擇）是唯一的。

如果你已經設計好了引物，要拿來驗證引物的好壞。可以在 Primer Parameters 區填入你的一條或一對引物。並且選擇好驗證的目標資料庫（在 specificity check 區選擇）。根據需要可設置產物的大小， Tm 值等。

在 specificity check 區，選擇設計引物或驗證引物時的目標資料庫和物種。這一步是比較重要的。這裡提供了 4 種資料庫： RefSeq mRNA, Genome (selected reference assemblies), Genome (all chromosomes), and nr (the standard non-redundant database)。前兩個資料庫是經過專家注釋的數據，這樣可以給出更準確的結果。特別是，當你用 NCBI 的參考序列作為模板和參考序列資料庫作為標準來設計引物時， Primer-BLAST 可以設計出只擴增某一特定剪接變異體基因的特異引物。

selected reference assemblies 包括以下的物種： human, chimpanzee, mouse, rat, cow, dog, chicken,zebrafish, fruit fly, honeybee, Arabidopsis, 和 rice。 Nr 資料庫覆蓋 NCBI 所有的物種。

用人尿嘧啶 DNA 糖基化酶(uracil-DNA glycosylase genes, UNG, GeneID: 7374)的兩個轉錄本序列作為一個例子來分析。 UNG1 的序列長一點（ NM_003362）， UNG2 的序列短一點（ NM_080911，注：拿這兩個基因的序列 ClustalW 一下就可以了）。這裡用 UNG2 的序列設計引物，選擇 RefSeq mRNA database，物種是 Human，其它默認。結果如下圖 A-B 所示，設計的引物只能擴增出 UNG2。看上面的圖，把「 Allow primer to amplify mRNA splice variants」這個選項給勾上，出現的結果如下圖C 所示，新的引物也可以擴增出 UNG1。

1，在任何時候都要優先使用參考序列的 Gi 號或 Accession 號（儘量不要使用 Fasta 格式的序列）。另外，確保你的序列是最新版本的（在填 Accession Number 時後面不加版本號就會自動拿最新的序列）

2，就算你對整個序列的某部分感興趣（如某條染色體上的某個區域），你也應該優化使用Gi號或Accession號（ Primer-BLAST 有參數可以設置設計引物的範圍，」 Form-To」，如上面的第一幅圖所示）。因為用Gi號或Accession號， NCBI 會自動讀取該序列的一些注釋數據，對引物的設計更加有利。

3，儘量使用沒有冗除的資料庫（如 refseq_rna 或 genome database）， nr 資料庫包括了太多的冗除的序列，會干擾引物的設計。

4，請指定一個或幾個 PCR 擴增的目標物種。如果不指定在所有的物種搜索，將會使程序變得很慢，引物的結果也會受其它不相關的物種影響。

好啦~今天的技能分享就到這裡啦，更多技能分析內容請點擊下方相關閱讀內容。我們下期再見哦~

 

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