動植物基因組中存在著大量重複序列，根據這些序列的重複程度，可將它們分為簡單重複序列、中度重複序列和高度重複序列。簡單重複序列(Simple Sequence Repeat，SSR)亦稱微衛星DNA（microsatellite DNA），其在真核生物基因組中廣泛存在，一般是以1-6bp組成的較低程度的重複序列。
作為建立在PCR基礎上的第二代分子標記，對SSR多態性分析做的第一步工作是SSR引物設計，今天給大家介紹一種基於perl腳本，整合了簡單重複序列鑑定軟體MISA（MIcroSAtellite identification tool）和Primer3的批量SSR引物設計方法。
前方高能，老司機開車了，大家坐好，出發咯~
MISA是一個用perl語言寫的一個從fasta序列中鑑定SSR的腳本。下載地址：http://pgrc.ipk-gatersleben.de/misa/misa.html，分別下載Misa.pl和misa.ini，其中Misa.pl從fasta序列文件鑑定SSR，misa.ini為SSR鑑定參數，默認：
definition(unit_size,min_repeats):1-10 2-6 3-5 4-5 5-5 6-5
interruptions(max_difference_for_2_SSRs):100
參數說明：1個鹼基重複10次及10次以上；2個鹼基重複6次及6次以上；3個鹼基重複5次及5次以上；4個鹼基重複5次及5次以上；5個鹼基重複5次及5次以上；6鹼基重複5次及5次以上的鹼基重複序列算是微衛星序列。兩個微衛星之間的距離小於100bp的時候，兩個微衛星組成一個複合微衛星。
除了需要下載Misa腳本，還需要下載Primer3軟體，下載連結：https://sourceforge.net/projects/primer3/files/primer3/1.1.4/primer3-1.1.4-WINXP.zip/download；以及Primer3輸入文件和輸出文件格式處理腳本p3_in.pl、p3_out.pl，下載連結：http://pgrc.ipk-gatersleben.de/misa/primer3.html。
SSR引物批量設計步驟：
1.perl 在windows作業系統下的安裝：從http://www.activestate.com/ activeperl/中獲得適合不同進位windows版本的activeperl；按照默認安裝在C 盤根目錄下。
2.將Misa.pl、misa.ini以及序列文件（以Trinity_unigene.fasta為例）放在一起，運行指令：perl Misa.pl Trinity_unigene.fasta，產生結果文件Trinity_unigene.fasta.misa（以表格的形式列出微衛星的類型和位點）和Trinity_unigene.fasta.statistics（統計微衛星的類型和頻數）。
3.p3_in.pl，生成Primer3輸入文件，指令為：perl Trinity_unigene.fasta.misa，產生了一個名為Trinity_unigene.fasta.p3in的primer3輸入文件；
4.primer3後，複製Trinity_unigene.fasta.p3in文件到primer3\bin根目錄下，運行primer3_core.exe實現批量的引物設計，具體操作：cmd打開打開命令提示符；cd primer3-1.1.4-WINXP\bin進入軟體操作路徑；
5.指令 primer3_core.exe< Trinity_unigene.fasta.p3in >Trinity_unigene.fasta.p3out，產生一個名為Trinity_unigene.fasta.p3out的文件；
6.運行p3_out.pl，指令為：perl p3_out.pl Trinity_unigene.fasta.p3out Trinity_unigene.fasta.misa，運行後得到Trinity_unigene.fasta.results文件，此文件為最終結果文件。
今天的分析技能就講到這裡了，有問題或者想了解更多分析技能的小夥伴，可以留言給小編哦~
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