301醫院郭全義團隊Bioactive Materials|生物3D列印仿生半月板

2020-12-10 上普生物

近期，301醫院郭全義主任團隊在Bioactive Materials期刊上發表了「3D bioprinting of a biomimetic meniscal scaffold for application in tissue engineering」的文章。301醫院周建及田壯為本研究的第一作者，郭全義主任，唐佩福主任，世紀壇醫院姚琦主任為本研究的共同通訊作者。

摘要：通過生物3D列印創建合適的仿生支架是治療受損半月板的有前途的方法。然而，鑑於半月板獨特的解剖結構和複雜的應力環境，許多研究已經採用了各種技術來充分利用不同材料的優勢，例如結合注射或靜電紡絲的列印來追逐仿生半月板，這使得該過程成為可能。在某種程度上複雜。一些研究人員僅通過生物3D列印解決了挑戰，而其替代材料和模型卻受到了限制。在這項研究中，基於多層仿生策略，研究者優化了半月板來源的生物墨水，甲基丙烯酸明膠（GelMA）/半月板細胞外基質（MECM）的製備，以兼顧可列印性和細胞相容性。隨後，採用了具有雙噴嘴+多溫度列印功能的定製生物3D列印系統（上普BioMaker），以整合聚己內酯（PCL）和載有半月形纖維軟骨軟骨細胞（MFCs）的GelMA / MECM生物墨水的優勢，從而完成了具有最佳仿生性的仿生半月板支架形態和成分方面的特徵。此外，進行細胞存活力，力學，生物降解和體內組織形成以確保支架具有足夠的可行性和功能性，從而為其在組織工程中的應用提供可靠的基礎。

圖1 半月板列印的工藝流程

生物墨水的選擇

精心設計的仿生構造可為半月板組織的再生提供合適的微環境。因此，在這項研究中，研究者試圖開發具有可印刷性和令人滿意的細胞相容性的半月板來源的生物墨水。當前用於生物3D列印的生物墨水主要由天然聚合物組成，包括藻酸鈉，明膠，膠原蛋白，殼聚糖，纖維蛋白，透明質酸和ECM 。其中，ECM保留了大多數天然成分，缺乏細胞免疫原性，是一種理想的生物材料，可以促進細胞增殖和分化。但是，由於ECM的成分複雜，它不溶於水和有機溶劑。因此，ECM很難被列印成3D結構。為了實現ECM的可列印性，由於僅MECM顯示出差的膠凝性能和令人滿意的形狀保真度。實驗中引入了明膠衍生物GelMA（上普G1）。可逆溫度敏感膠凝與簡單，快速的光交聯結合在一起，已得到了廣泛的應用。此外，它的強大的生物相容性使其成為極好的選擇。因此，在這項研究中，通過將MECM與特定濃度的GelMA混合，製成了既具有可列印性又具有細胞相容性的半月板來源的生物墨水。

圖2 半月板脫細胞基質材料表徵

列印工藝的調節

分析生物墨水的特性對於優化列印參數至關重要。一些研究人員研究了GelMA的流變性能，並揭示了一定的穩定性和剪切稀化特性。本文研究者的研究結果充分表徵了GelMA / MECM的流變學特性，表明該生物油墨具有類似的特性。此外，這項研究表明，GelMA / MECM生物墨水對溫度敏感，並具有明顯的延遲，需要超過30分鐘才能達到穩定性。由於在列印過程中零件之間的相互熱幹擾，GelMA / MECM的粘彈性可能存在一些波動，這些波動可能會影響列印的平滑度和細胞的活力。因此，在這項研究中，選擇了電機驅動列印而不是氣動驅動列印。因此，即使GelMA / MECM由於溫度波動而表現出一定的粘彈性變化，也不會明顯影響列印過程的平滑性。

多噴頭列印技術極大地擴展了可以選擇的材料範圍，這有利於構建複雜的3D模型。但是，不同噴嘴和不同材料的配合仍然涉及許多細節。因此，有必要探索每種材料的印刷條件。在載有細胞的水凝膠的印刷方面，基於生物墨水和細胞的類型存在一些差異。在這項研究中，為確保高保真度和高細胞活力（大於90％），需要反覆調整包括GelMA / MECM濃度比，噴嘴的內徑，列印溫度和列印速度在內的各種參數。PCL的列印相對簡單，唯一要點是調整列印溫度和速度。這項研究中的挑戰是如何很好地協調兩個噴嘴和材料，以同時保證結構穩定性，細胞活力和所需的機械性能。經過反覆試驗，最終確定以85°C為最佳PCL列印溫度，並根據凝膠動力學確定了20°C的水凝膠列印溫度。列印平臺溫度為20°C也是絕對突出的條件，有助於防止GelMA / MECM凝膠由於交聯前相對較高的室溫而轉變成溶液。否則，可能會破壞孔的形成。實際上，要解決整個過程中的關鍵問題，需要對材料和列印原理有充分的了解，並且這樣的了解將允許在不同領域中順利創建許多定製模型。

圖4 生物墨水的流變學分析

圖5 半月板仿生支架

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半月板列印視頻

細胞活性

細胞活力和機械性能是用於驗證該研究模型成功的初步標準。許多因素，包括生物墨水成分以及列印模型和參數，都會影響列印過程中的細胞活力。在這項研究中，使用單噴嘴和雙噴嘴印刷進行細胞活力測試，然後在體外培養1天和14天。細胞活力超過90％。此外，將水凝膠培養長達6周，細胞活力保持在90％以上。這些數據證明了該列印模型的可行性以及該研究中所用材料的良好細胞相容性。

圖3 生物墨水的細胞毒性評價

圖6 列印後的細胞活性

力學性能

總體而言，這項研究解決了穩定性和均勻性的問題，就機械性能而言，研究者試圖增加PCL單絲間距並減小PCL單絲直徑以實現更好的機械仿生。最終，PCL單絲直徑設置為500μm，間距設置為1000μm。構造物的壓縮模量為12.63 MPa，高於人類半月板的壓縮模量（0.3–2 MPa）。此外，受積分模型的限制，拉伸模量為24.86 MPa，在徑向方向上接近半月板的拉伸模量（4-20 MPa）。但是，與周向拉伸模量（78-120 MPa）相比，仍然存在很大差異。

圖7 列印支架的力學性能

體內降解分析

隨著螢光成像技術的發展，可以以無創方式在體內連續監測水凝膠，從而為評估水凝膠的生物降解提供了一種有效而可靠的方法。這項研究考慮了這些因素，並結合了可用技術設計了定製的生物降解研究方案。首先，研究者將印有細胞的水凝膠支架培養長達八周，以驗證其基本穩定性。然後，在原位植入支架以評估PCL的生物降解，並在小鼠皮下植入Cy7標記的支架以通過體內成像監測水凝膠的降解。結果表明，支架中水凝膠的生物降解需要大約一個月的時間。分子量和納米壓痕測試的結果用於評估PCL骨架的原位降解。有關PCL結構生物降解的結果與其他研究相似。支架的分子量在3個月時沒有顯著差異，但在6個月時有所降低。但是，一些支架在3個月時開始出現損傷，而在6個月時僅可見這些支架的剩餘部分。最初的微環境可能對支架的完整性影響很小，並且隨著時間的延長和分子量的降低，支架的強度逐漸減弱，從而導致上述結果。該結果表明，半月板的機械環境可能起決定性作用。

圖8 皮下水凝膠降解的定量螢光分析

結論

藉助定製的雙噴頭+多溫度控制列印系統和半月板衍生的生物墨水，本研究充分結合了PCL和GelMA / MECM / MFCs的優勢，從而在形態上初步實現了與天然半月板類似的仿生支架包括形態，機械性能，成分組成和微環境。這種方法明顯提高了仿生半月板支架在組織工程中的水平和效率。此外，進行了各種實驗以確保支架在各種應用中的可行性和功能性。然而，該支架在某些方面仍與天然半月板不同。 PCL具有很大的硬度和不足的柔韌性。 MECM在脫細胞後失去其原始的物理性能，並且僅通過材料的逐層堆疊才能實現部分仿生，這與高度交聯的半月板膠原纖維的環狀排列不同。因此，材料科學和列印技術的改進可能是推動組織工程學發展的關鍵。當前，不同技術的結合對於實現半月板的更高水平的仿生品可能是有效的。

參考文獻

Zhou Jian, Tian Zhuang, Tian Qinyu, Peng Liqing, Li Kun, Luo Xujiang, Wang Diaodiao, Yang Zhen, Jiang Shuangpeng, Sui Xiang, Huang Jingxiang, Liu Shuyun, Hao Libo, Tang Peifu, Yao Qi, Guo Quanyi,

3D bioprinting of a biomimetic meniscal scaffold for application in tissue engineering,Bioactive Materials,Volume 6, Issue 6,2021,1711-1726

https://doi.org/10.1016/j.bioactmat.2020.11.027.

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