文章來自「科學大院」公眾號
作者：谷猛
紫杉醇的大名很多人都聽過，這種從紅豆杉樹中提取的天然藥物是抗癌的明星產品。它給許多患者帶來希望的同時，也給紅豆杉樹造成了毀滅性的打擊。
那有沒有辦法人工生產紫杉醇呢？這就要靠那些「小不點」啦！
正在化療的癌症患者（圖片來源：veer）
01 風光無限的紫杉醇
紫杉醇藥物自從1992年被美國食品藥品管理局（FDA）批准上市以來，銷售額屢創新高，1994年銷售額就達到4億美元，2000年銷售額更是達到16億美元，創下單一抗癌藥銷量之最。目前，紫杉醇已成為世界銷量第一的抗腫瘤藥物，也是世界上公認的強活性廣譜抗腫瘤藥物，被譽為20世紀90年代抗腫瘤藥的三大成就之一（其他成就：喜樹鹼、維A酸）。
紫杉醇具有什麼獨特的抗癌機制，能獲得如此多的讚譽和肯定呢？這就不得不提到一位女科學家Susan Band Horwitz博士。Horwitz博士通過長期研究，最終於1979年闡明了紫杉醇獨特的抗癌作用機制。2019年，Horwitz博士也憑藉這項研究成果榮獲素有「小諾貝爾獎」之稱的加拿大蓋爾德納國際獎。
Susan Band Horwitz博士 （圖片來源：https://www.pnas.org）
紫杉醇抗癌，首先要從微管蛋白說起。
微管蛋白是細胞體內重要的物質，存在兩種形態——細胞正常時微管蛋白和細胞分裂時形成的微管蛋白二聚體。微管蛋白不斷發生著組裝和降解，才能讓細胞正常進行分裂活動。
紫杉醇的作用便是促進微管蛋白聚合形成二聚體，同時防止二聚體構成的微管解聚。也就是說，紫杉醇會讓細胞在分裂過程中被「卡住」，細胞就會停止分裂，進而發生凋亡。本來可以無限分裂增殖的癌細胞被按下了暫停鍵，紫杉醇的抗癌作用也就得到發揮了。但是紫杉醇不光對癌症細胞起作用，也能對正常分裂的細胞起作用。為了降低其副作用，目前通常採用紫杉醇包埋靶向藥物載體的方式對癌症部位進行靶向治療，有效減少對機體其他正常分裂細胞的副作用。
對照（左）細胞正常分裂；紫杉醇（右）抑制細胞微管的解聚，阻止細胞分裂 （圖片來源：參考文獻17）
此外，隨著對紫杉醇的不斷深入研究，科學家還發現紫杉醇不僅可以用於治療卵巢癌、乳腺癌、肺癌等癌症疾病，還可以用於製備心臟支架的藥物塗層，來抑制血管繼續變窄等作用，同時也是研究微管的結構、動力學和功能的重要工具。
雖然紫杉醇具有如此多的優點，但卻存在著一個致命的缺陷——原材料供應。
02 兩難之境：紫杉醇原材料問題
紫杉醇唯一的原料來源便是數量極其稀有的紅豆杉。紅豆杉，又稱紫衫或赤柏松，最早起源於中侏羅紀，是遠古第四紀冰川遺留下來的古老孑遺植物，是世界上公認瀕臨滅絕的天然珍稀抗癌植物，數量極其稀少且生長緩慢僅在北半球存在零星分布，是我國國家一級保護植物，被稱為「植物界的大熊貓」。
紅豆杉照片（圖片來源：Wikipedia）
紅豆杉的樹皮中紫杉醇含量最高，但最高含量也才僅為0.01％—0.02％。正因如此，粗品紫杉醇的價格曾一度炒到200萬美元/公斤，面對高額收購價，利益薰心的人終於坐不住了，紛紛開始對植物界的「大熊貓」紅豆杉下手。
「匹夫無罪，懷璧其罪」，因為含有紫杉醇，在二十世紀末的幾年時間裡，全球超過80%的紅豆杉被砍伐一空，中國雲南滇西橫斷山區中的300多萬棵紅豆杉也不能倖免遇難，大部分被剝掉樹皮，默默死去。直到各國國家出臺法律嚴禁砍伐，這場「屠戮」風波才慢慢停息。
從自然資源中提取藥物，造福患者，本是件治病救人的好事，但如何在藥物開發和保護自然資源之間尋求平衡，這是我們今天必須面對的現實問題。
03 小不點的大作用
面對紫杉醇原料供應的兩難之境，各個領域的科學家開始進行不同的嘗試。
首先是化學全合成和半合成策略。
化學全合成是指利用化學結構簡單的化工產品為起始原料經過一系列化學合成反應和物理處理過程製得最終產物。早在上個世紀七十年代初，紫杉醇便憑藉複雜和新穎的化學結構吸引了全球30多個頂尖化學實驗團隊參與到其化學全合成中，在之後三十年間，陸續有七個研究小組完成途徑各異的合成途徑，但合成步驟過長（最少也需要37步），不僅需要使用昂貴的化學試劑，而且反應條件極難控制，收率也偏低（最高也才3%左右）。因此，利用化學全合成生產紫杉醇的想法只能作罷。
10-DAB(左)與紫杉醇（右）化學結構對比 （圖片來源：參考文獻2）
但與化學全合成相伴而生的半合成策略卻帶來意外的驚喜，半合成則指用具有一定基本結構的天然產物後經化學結構改造和物理處理過程製得最終產物。1981年法國Pierre Potier教授首次從英國紫杉的葉子分離得到跟紫杉醇具有相同母核結構的化合物10-deacetyl baccatin III（10-DAB），並隨後利用其為原料成功合成紫杉醇。該方法比天然提取成本低，且對環境生態更加友好。因此利用人工培育速生紅豆杉的枝葉作為原料加上化學合成的生產紫杉醇途徑開始全面應用，大大緩解了紫杉醇的藥源供應問題。紫杉醇的價格也出現嚴重的「高臺跳水」，身價也由200萬美元/公斤變成現在2-4萬美元/公斤。
Pierre Potier教授為紫杉醇的半合成途徑做出卓越貢獻（圖片來源：https://www.nature.com/articles/440291a）
但是，只要利用植物來源作為前體，就不得不考慮植物生長的周期性、外界天氣及其季節等因素導致成本問題，這些都是制約紫杉醇的價格繼續下降的重要原因。不過隨著生物技術的不斷進步，不起眼的「小不點」——微生物卻能起到重要的作用。
微生物作為藥物來源的優點：
1. 微生物生長繁殖速度快：微生物生長迅速，長的最快的微生物十幾分鐘之內便可進行一次分裂，易於縮短生產周期，而且還易於培養。
2. 微生物遺傳操作簡單：工程師對一些明星微生物「知根知底」，用來改造他們的工具也比較完善，這些工具能夠助力工程師對微生物進行改造，用於生產紫杉醇。
3. 易於大規模工業生產：在工業上可用發酵罐進行大規模培養並生產紫杉醇，不受天氣等因素的影響，同時目前微生物規模化發酵生產的技術較為成熟。
微生物作為紫杉醇的藥源既然有這麼多優點，那現在發展又如何呢？
04 如何用微生物生產紫杉醇呢?
利用微生物作為藥源生產藥物的關鍵，在於如何從數量眾多的微生物中選擇合適的那種或那幾種微生物進行生產，目前存在兩個思路：一是利用本身能產該化合物的微生物進行生產，二來則是利用合成生物學的思路將能產該化合物的途徑給「挖過來」安裝在如大腸菌株等工程菌株進行生產。因此，我們就這兩個途徑分別跟大家來聊聊。
1.內生菌發酵
內生菌是一種寄生在健康植物體內的微生物，不會造成任何病狀，同時還能給寄主提供反抗昆蟲、草食性動物、病原體等作用。1993年美國兩位科學家Stierle教授和Strobel教授在紅豆杉的樹皮中發現一種內生真菌——安德氏紫杉黴(Taxomyces andreanae)，它能夠自主產生紫杉醇，這一研究發現讓正在解決紫杉醇原料來源問題的科學家大為興奮，他們開始了對內生真菌的菌種分離和選育工作。到目前為止，已經記錄的超過40個真菌屬的近200個內生菌能夠生成紫杉醇，其寄主範圍也不僅限於紅豆杉屬植物，還包含禿柏、Wollemi松及Torreya grandifolia等非紅豆杉屬植物。
不同種植材料生長的內生真菌菌落。A樹皮碎片，B種子，C樹枝（圖片來源：參考文獻13）
雖然內生真菌介導的發酵過程是一種很有前途的生產紫杉醇的替代方法，但產量不穩定、產量低是開發內生菌生產紫杉醇的巨大挑戰。目前報導的產率是從0.001 ng/mL到800 ng/mL不等，遠遠達不到用於生產的標準，同時還有大部分內生菌實驗結果無法重複或者在傳代過程中失去生產紫杉醇的特性。這些現象也讓不少研究學者質疑，這些內生菌獨立於宿主植物外是否還存在合成紫杉醇的能力。雖然也有研究人員從共生、外界環境刺激角度展開研究，來解釋內生菌在傳代過程中出現的產量下降的問題。但因缺少對內生菌體內具體合成途徑的信息，也很難深入研究，這一缺點也是制約內生真菌發酵的問題所在。
2.合成生物學
既然直接利用內生菌進行生產難度比較大，那如果改變策略，將植物體內產紫杉醇途徑的相關基因移植到適合生產的工程菌株上是否可行呢？
2001年，Huang QL等人將紫杉醇前體的紫杉醇二烯（taxadiene）合成途徑的相關基因導入到大腸桿菌系統中，相關基因成功在大腸桿菌體內表達，其產量為1.3 mg/L的紫杉醇二烯。之後，酵母系統也成功表達並能夠生產紫杉醇二烯，到目前為止，最高的異源紫杉二烯產量為大腸桿菌的1.02g/L和釀酒酵母72.8 mg/L。這些結果都表明將紫杉醇合成途徑導入到大腸桿菌、酵母等工程菌株中是具有一定可行性的策略，且有很大發展潛力，這種相關基因異源表達的方法也是目前主流研究紫杉醇生物合成的方法。
大腸桿菌多元模塊化代謝途徑 （圖片來源：參考文獻16）
到目前為止，雖然異源表達系統構建已經取得了驚人的成績，但距離真正微生物生產紫杉醇甚至10-DAB都還有一定的距離，存在一些問題如植物體內紫杉醇是如何生物合成，每一步是由哪些基因表達的蛋白起的作用，如此複雜且漫長的紫杉醇生物合成途徑又要如何導入到異源系統中等等有待解決。相信隨著合成生物學，基因編輯，人工底盤細胞的開發等技術的不斷進步，在不久將來定能夠實現利用微生物產紫杉醇的宏願。
05 展望
紫杉醇從發現、生產和應用經歷了幾十年的研究，在無數科學家的努力下，曾經只能通過提取珍貴紅豆杉樹皮才能獲取的紫杉醇，到現在只需收穫枝葉便可以化學合成，未來我們也許利用異源表達的策略和微生物發酵技術，就能源源不斷地生產紫杉醇，紫杉醇藥物價格也不再會成為患者的經濟負擔。
前有青蒿酸生物合成的工業化應用作為先驅，後有不斷探索的紫杉醇微生物合成，「小不點」微生物已經開始在植物源天然產物的生物合成領域嶄露頭角了。相信在不久的將來，利用微生物獲取更多對人類有益的植物源天然產物將會越來越多的成為可供選擇的方案。
策劃：李輝 呂雪峰
作者單位：中國科學院青島生物能源與過程研究所 微生物製造工程中心
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