本文作者：Patrick
呼氣檢測起源辨味識病
第一個用於確定人類生理狀態的呼吸分析起源於希波克拉底時期（公元前460-370年），當時古希臘醫生意識到可以從患者呼吸的特徵氣味中診斷出某些疾病，並且知道人的呼吸可能會提供有關健康狀況的健全信息。在後來的醫學實踐中，醫生能夠很容易分辨出糖尿病患者、晚期肝病患者、腎衰竭患者和肺膿腫患者呼吸中的「水果味」（丙酮）、「黴味」、「魚腥味」、「尿味」和「腐臭味」[1]。對呼出氣中存在的VOCs的分析可以提供患者病理生理狀況的寶貴信息，這些化合物是各種疾病和代謝活動的潛在診斷生物標誌物。
圖一 呼出氣成分示意圖
來源：Owlstonemedical.com
高精度分析質譜儀的出現極大促進呼氣檢測科研發展
近代提出呼氣代謝組學（breath metabolomics）的概念，當發生從健康狀態到病理狀態的轉變時，人體呼氣中的揮發性有機物( volatile organic compounds，VOCs)分布將被改變，並且可以被檢測到並用於診斷和監測。從1970年代Pauling團隊使用氣相色譜儀（GC）檢測人類呼吸中200多種VOCs之後，越來越多科研團隊在研究呼氣代謝組學。
圖二 1980~2015年間呼出氣VOCs發表文章數統計
來源：breath biopsy complete guide
呼氣中揮發性有機化合物的來源包括環境（稱為外源性），宿主（內源性）以及微生物組（居住於口腔，肺和腸道的微生物）。而宿主產生的VOCs是與臨床疾病相關中研究最多的，用於診斷目的的呼氣VOCs主要包括含：
表一 呼氣VOCs的化合物分類[2]
呼氣檢測已經在臨床應用，更多檢項仍待開發
在臨床實踐中已經建立了一些使用揮發性生物標誌物的呼氣檢測。但由於尋找疾病生物標誌物的研究之間缺乏可重複性，VOCs檢測在臨床應用中沒有得到充分開發。
表二 已經實際使用的呼氣檢測項目
來源：Johns Hopkins medicine、奇蹟之光整理
腫瘤和感染性疾病篩查診斷是呼氣檢測未來的發展方向
在病理生理過程中，細胞代謝的改變會導致生化反應副產物VOCs的變化。包括缺氧、細胞過度增殖、過度的炎症和活性氧活性以及其他與癌症相關的病理機制都會導致局部和系統性VOCs的譜圖和濃度發生明顯變化。生物學家已提出了幾種潛在的生化途徑機制。例如，由於缺氧和/或炎性疾病，在癌症的微環境中的氧化應激有助於烷烴和甲基化烷烴的形成。癌症患者中細胞色素P450酶的過度活化可能會提高酒精水平。由局部缺氧引起的過度細胞增殖導致無氧呼吸，其中能量產生的糖酵解途徑釋放出酮和醇。
在眾多研究中也發現在肺癌中呼氣VOCs與體外細胞系中的VOCs部分重疊。表明除了癌細胞直接釋放的VOC外，與疾病本身相關的繼發性和/或全身性機制也會產生，這意味著VOCs作為標誌物可以更全面的對人體生理病理狀態做出判斷[3]。
現已知253種VOCs與不同腫瘤部位的癌症診斷有關，在大多數情況下，這些揮發性有機化合物主要是碳氫化合物（芳香族和脂肪族）和含氧化合物（即醛、醇、酚、羧酸、醚和呋喃），而含氮、硫和滷素的化合物較少。其中與癌症相關的最常見的是2-丁酮、1-丙醇、壬醛、異戊二烯、乙苯、4-甲基辛烷、3-羥基-2-丁酮、丙酮、甲苯、乙醇、戊醛、庚醛和戊烷等[4]。
表三 腫瘤患者呼出氣VOCs的臨床一期研究（不完全統計）[4]
多項研究表明檢測呼吸中的VOCs指紋圖譜或化學基團可將患有微生物感染的個體與健康對照區分開[5]。由於細菌獨有的新陳代謝產物是人類自身無法產生的，其中細菌特異性VOCs可以作為標誌物進行診斷。比如膿毒症常見的六種菌（金黃色葡萄球菌、肺炎鏈球菌、糞腸球菌、銅綠假單胞菌、肺炎克雷伯菌和大腸桿菌）均產生異戊醇、甲醛、甲硫醇和三甲胺。而這六種菌株又各自產生特異性的金黃色葡萄球菌的異戊酸和2-甲基丁醛；用於銅綠假單胞菌的1-十一碳烯、2-丁酮以及大腸桿菌的甲醇、戊醇、乙酸乙酯和吲哚等[6]。
對於病原感染來說現有很多檢測方法，但是各有各的優缺點。常用的急性感染蛋白標誌物有CRP、PCT和SAA等，這類檢測的優點是快速便宜，但是無法精準辨別感染的菌種類別。而新晉的核酸檢測包括PCR、mNGS等優點是可以對感染菌種準確分型，且可以分析耐藥信息以獲得更好的用藥指導及預後。但是檢測周期較長，對不同感染類別的取樣及樣本類型要求複雜多變以及價格較高是限制臨床全覆蓋的重要因素。因此一個檢測方便快捷、價格便宜且可以對菌種分型鑑定的呼氣檢測有其獨特的臨床優勢。
表四 部分感染性疾病及其潛在VOCs
來源：奇蹟之光-文章整理
樣本採集的標準化可以提高檢測結果的重現性
宿主和共生微生物的內源性VOCs相互作用大大增加了呼氣代謝組的複雜性，而且呼氣中VOCs含量通常非常稀少，低至百萬分之幾（ppmv）甚至十億分之幾（ppbv），因此要實現可靠、高質量、標準化的呼吸採樣及分析檢測存在相當的挑戰。
圖三 呼氣採集流程[7]
樣品預濃縮方法與高靈敏度的分析儀器至關重要，樣本採集核心是採集到不包含環境氣體成分的內源性氣體，以供精確分析和避免幹擾因素。
一次連續的呼氣根據CO2分壓分為四個時項相，分別是死腔通氣、死腔通氣及肺泡內氣體體混合過渡期、肺泡氣和呼氣末期。相比於階段Ⅱ和階段Ⅲ的混合採樣來說，階段Ⅲ的採樣更具有代表性，且避免了引入外源性氣體帶來的檢測結果假陽性。採樣的原則是在獲取呼吸樣本時需要嚴格控制流程並保證採樣可重現。
圖四 時間-二氧化碳分壓波形圖[7]
樣本預濃縮有助於提高檢測性能，但帶來樣本損耗及重現性差
由於傳統的分析方法限制，需要對樣本進行預濃縮以提高分析精度，同時也一定程度降低分離純化過程中會帶來的巨大損耗。常見的氣體樣本濃縮方法有熱脫附（TD）管和固相微萃取（SPME）。
熱脫附管用吸附劑把氣體吸附富集，再通過加熱的方式解吸附釋放到檢測儀器中。常用的吸附劑包括Tenax TA & GR、Carbograph 5TD、碳分子篩（Carboxen）等。為了防止分析物的過度吸附損失導致失去一些痕量的潛在VOCs標誌物，對挑選吸附材料也極為講究。但無論是在揮發性還是在極性方面，填充界面的分析物與吸附劑之間的相互作用會一定程度的影響重現性，從而影響化合物的回收率，甚至可能影響儲存期間的穩定性。
固相微萃取是一種非常簡單有效的無溶劑樣品製備方法，可以把常規液-液萃取的所有步驟包括萃取、濃縮和轉移檢測都集成到一個設備中，從而大大簡化了樣品製備過程。它將塗覆的熔融石英纖維暴露於樣品的頂部空間，然後使用聚二甲基矽氧烷（PDMS）和聚丙烯酸酯（PA）塗層材料作為吸附，樣品中的分析物被直接富集到纖維塗層中，最終與氣相色譜法聯用進行VOCs的檢測[8]。
但無論是吸附柱也好，固相微萃取也好，都無可避免因為富集帶來的富集材料選擇、耗材成本高和吸附損耗問題。這會極大影響樣本檢測的重現性，從而影響結果的準確性。無需富集的高靈敏在線分析儀器則很好解決了這些難題，也是推向臨床應用的一大重要因素。
可靠、標準化和高質量的在線分析是臨床發展方向
目前科研最常用的是高靈敏GC–MS分析系統，結合預濃縮系統可以有效地離線收集、分離和鑑定人呼吸中大多數化合物，如脂族化合物、醇、醛、酮、胺及滷代化合物，也足夠敏感去量化ppbv水平的VOCs。但GC-MS的耗時、昂貴、富集損耗、操作困難、無法實時檢測和重複標準化測量是臨床應用的巨大阻力。
E-nose電子鼻利用納米傳感器陣列檢測呼出VOCs的複雜混合物的已知成分，具有小型化便攜、實時分析成本便宜的優勢，但對於複雜疾病的研究和低濃度VOCs的精準定量分析卻無能為力。
相比於GC-MS，質子轉移反應質譜（PTR-MS）檢測VOC濃度可達pptv水平，可在線多次檢測且不需要費時昂貴的預濃縮步驟，目前已用於監測麻醉、呼吸曲線和血液透析。但是對於VOCs分析而言也存在難檢測低碳烷烴類物質及細菌代謝相關硫化物的局限。
大連化物所新開發的SPI-TOF利用複合電離技術能夠快速在線分析氣體中的痕量成分，其重複性好、碎片化程度低且無需預富集，具有成為VOCs標準分析工具的潛力。
表五 現有VOC檢測技術及性能對比
來源：奇蹟之光整理
商業化尚未成熟，機會眾多
不完全統計國際上呼氣相關的公司有9家，分布在各個國家，其中Owlstone是最有代表性的融資最多的企業，但離領軍地位還有一段距離。
商業化的檢測技術主要有質譜（GC-MS、SIFT-MS、FAIMS、SESI-MS）和傳感器。大多數公司成立於2015年後，仍在做技術優化和臨床驗證，整個行業處於早期發展階段，競爭並不激烈。產品管線多集中在肺部疾病、腫瘤、血糖和消化系統疾病。美國國家癌症研究所提供200萬美元贈款資助Menssana Research多中心盲法研究，多家企業也連續拿到了融資，行業發展趨勢良好。
表六 商業化公司不完全統計
來源：奇蹟之光整理
呼氣檢測行業的轉折點已經到來，產業爆發指日可待
從古代辨味識病到現在代謝組分析，一直朝著呼氣檢測的方向進行突破。但是由於代謝組學的複雜性，呼氣檢測流程中樣本採集、樣本濃縮及分析流程沒有標準工具和流程優化，導致產業化困難重重。所有的基礎研究都在探索不同的氣體採集方式，採用不用策略的樣本濃縮，並且需要處理吸附-解吸附的損耗和分離偏差的問題，最終學術上對於同一病種的VOCs標誌物組合沒有一個明確的定論。
隨著在線分析技術進一步迭代升級，將無需樣本濃縮帶來的系統誤差。同時，高靈敏度分析儀器可以標準化高通量分析樣本。在疾病的篩查診斷上的標誌物會逐步形成共識，低成本操作簡便的非侵入式呼氣檢測正處於產業爆發的前夕。
【參考文獻】
[1]Francesco FD, Fuoco R etc.Breath analysis: Trends in techniques and clinical applications. Microchemical Journal. 2005;79:405–410.
[2]Souvik Das, Saurabh Pal, Madhuchhanda Mitra.Significance of Exhaled Breath Test in Clinical Diagnosis: A Special Focus on the Detection of Diabetes Mellitus. J Med Biol Eng. 2016; 36(5): 605–624.
[3]Hakim M, Broza YY, Barash O, et al. Volatile organic compounds of lung cancer and possible biochemical pathways. Chem Rev 2012; 112: 5949–5966.
[4]Hanna GB, Boshier PR, Markar SR, Romano A. Accuracy and Methodologic Challenges of Volatile Organic Compound–Based Exhaled Breath Tests for Cancer Diagnosis: A Systematic Review and Meta-analysis. JAMA Oncol. 2019;5(1):e182815. doi:10.1001/jamaoncol.2018.2815.
[5]Waqar M. Ahmed,Orcid etc.Exhaled Volatile Organic Compounds of Infection: A Systematic Review.ACS Infect. Dis. 2017, 3, 10, 695–710.
[6]Lieuwe D.J.Bos,PeterJ.Sterk.Volatile Metabolites of Pathogens: A Systematic Review.plospathogens. May 9, 2013.
[7] Exhaled breath analysis: a review of 『breath-taking』 methods for off-line analysis；Oluwasola Lawal, Waqar M. Ahmed etc.Metabolomics. 2017; 13(10): 110. Published online.
[8]Solid-phase microextraction: a powerful sample preparation tool prior to mass spectrometric analysis.Vas G, Vékey K. Mass Spectrom. 2004 Mar; 39(3):233-54.
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