線性還是非線性，用 GRaMM 便知一二

文獻速遞

目前有多種相關分析方法被應用於確定 microbe–metabolite 關係。今天分享一個能考慮不同組學數據的特點，適用於 metabolome （代謝組）和 microbiome （微生物組）的分析策略— GraMM (Generalized coRrelation analysis for Metabolome and Microbiome)。

GRaMM 通過整合多種方法可以處理兩類組學數據，消除混雜因子的影響，獲得線性和非線性的關係。

GRaMM 包括 4 個步驟：代謝組和微生物組數據的預處理；線性或非線性關係的識別；數據矯正和相關性計算；p 值矯正。

在多個模擬和真實數據集中，與其他三種方法比較，評估 GRaMM 的性能：準確性，敏感性，特異性，假陽性率，適用性以及數據預處理和混雜調整步驟步驟的效果。GRaMM 是為代謝組和微生物組的相關性分析設計的策略。Matlab 函數和 R 包免費提供，供學術研究使用。

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Keywords: GRaMM, MIC, MECC, preprocessing, confounder adjustment

Title: A Strategy for Inter-correlation Identification between Metabolome and Microbiome

DOI: 10.1021/acs.analchem.9b02948

Journal: Analytical Chemistry [IF 6.35]

First Authors: Dandan Liang, Mengci Li

Correspondence: Wei Jia, Tianlu Chen

Affiliation: Shanghai Key Laboratory of Diabetes Mellitus and Center for Translational Medicine, Shanghai Jiao Tong University Affiliated Sixth People's Hospital, Shanghai, China.

Published: 2019-10-22

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研究背景

在組學研究領域，Pearson, Spearman, LR, SparCC, CCLasso 被用於確定微生物組的相關性。maximum information coefficient （MIC） 可以捕獲線性和非線性相關性。partial least squares (PLS) 和 canonical correlation analysis (CCA) 被應用於微生物組和代謝組的相關性分析。

代謝組和微生物組數由於獲取方式的不同，數據特徵不同。代謝組數據是連續譜數據，微生物組是基於序列的「計數」方法。此外，代謝組數據是高度稀疏的，通常用相對豐度表示。因此，數預處理（如：歸一化，log轉換）對下遊分析有益。混雜因子（如：年齡，性別，飲食等）可能導致結果偏差。計算相關性時，可以用少量方法（如：LR 和淨相關）調整混雜因子。真實數據集中中存在多種類型相關性（線性，非線性和無相關性）。除了MIC，其他現存分析方法都只能捕獲線性或單調相關性。

GRaMM 綜合考慮上述挑戰和現存方法的特徵，並系統地評估 GRaMM 的效果：（1）在模擬數據集中，與其他三種方法（LR, Spearman 和 MIC）比較，評估基本性能（如：準確率，敏感性，特異性和假陽性率）。（2）在真實數據集中，用 GRaMM 數據重分析，比較結果。（3）用 4 個真實數據集，基於不同樣本來源（mice, rats 和 human）以及不同數據類型（腦組織，腸內容物，盲腸內容物和糞便），測試 GRaMM 的適用性和重複性。

研究思路

GraMM 流程圖：（1）預處理：代謝-- log 轉換和總強度歸一化；微生物-- 總強度歸一化，稀釋和居中對數比變化。（2）確定相關類型：線性：p<0.05 或 r > 用戶設定的值；非線性：不滿足上述條件。（3）混雜因子：線性（無）-- LR；線性（有）-- mLR（微生物數據和混淆因子做自變量，代謝數據是因變量）；非線性（無）-- MIC；非線性（有）-- MCEE 移除特定混雜因子的影響，不需要額外實驗，不丟失樣本/變量。

研究結果

1.模擬數據比較四種方法

作者首先模擬兩個沒有混雜因子的模擬數據集（SDatabase1，SDatabase2），隨之進行數據預處理：微生物組數據用總強度歸一化。

• SDatabase1：240 組線性對和 120 組非線性的微生物-代謝物對
• SDatabase2：240 組隨機產生的無相關性的微生物-代謝物對

使用 SDatabase1 數據集的 240 對線性相關數據，比較 4 種方法的效果。結果發現：與 spearman LR 相比，GRaMM 的 r 值離散程度小（圖 1a）；GRaMM，LR 和 Spearman 的 RMSE 值(root means square error，準確性評估指標) 低於 MIC （圖 1b）。表明：MIC 適用於非線性關係。

使用SDatabase2 數據集，發現：GRaMM 的 FPR (false positive ratio，假陽性率) 高於其餘三種方法（圖 1c）。因為 GRaMM 綜合利用 LR，MIC 以及其他方法，儘可能多的找相關的配對。p 值矯正減少假陽率。

使用 SDatabase1 和 SDatabase2 數據集，ROC 分析計算 4 種方法的 p 值。GRaMM 有最高的AUC值 (0.971)，最低的 SE值（0.006）（圖 1d）。GRaMM 優於其他的線性分析方法(LR 和 Spearman)。

使用 SDatabase1 中的 120 對非線性的microbe–metabolite。發現：相較於 LR 和 Spearman，MIC 和 GRaMM 可以確定更多的相關對（圖 1e）。MIC 和 GRaMM 的 RMSE 值低於 LR 和 Spearman（圖 1f）。基於F1函數得到的非線性對，GRaMM 的結果和Spearman 和 LR 更接近，關係更接近線性（圖 1g）；基於 F2-F6 函數得到的非線性數據對，GRaMM 的結果和 MIC 更接近，關係更接近非線性（圖 1h-1l）。

總之：GRaMM 在準確率，敏感性，特異性和識別線性以及非線性關係的能力方面優於其他方法。

圖 1. 基於模擬數據集，比較 4 種方法的性能

2.數據預處理的效果

代謝數據做 log 轉換；微生物組數據做總豐度歸一化 和 log-ratio (CLR) 轉換 。

基於 SDatabase1 和 SDatabase2 數據集，比較數據預處理的效果。發現：代謝數據（圖2a）和微生物組數據（圖 2b）處理後更接近正態分布。此外，還發現：數據預處理之後，GRaMM，LR 和Spearman 方法的 AUC 值增加；MIC方法沒有變化（圖 2c）。可能是由於 MIC 受數據分布和結構影響較小。

GRaMM 的數據預處理幾乎對所有的該方法都是有益的。

圖 2. 基於模擬數據集，有效的數據預處理

3.Real Dataset 的評估結果

使用的2個真實數據集：

• RDatabase1：42 只小鼠的 17 個門水平的微生物和 14 個代謝物
• RDatabase2：42 只小鼠的 18 種膽汁酸和42 個 Firmicutes 下的 genu/species

基於不同的距離方法（Unweighted Unifrac, weight Unifrac, Hellinger, JSD, Spearman,

使用 RDatabse1 ，評估 GRaMM 的性能和數據預處理的效果。發現：GRaMM 可以確定更多的相關對，數據預處理後，MIC 的相關對減少的較少（圖 3a）。GRaMM 聯合LR 和MIC 方法，捕獲線性和非線性關係。更多的線性關係確定，GRaMM 與 LR 和 Spearman 結果更相近。混雜因子調整之後，GRaMM 和 LR 的相關對數目較少（|r| > 0.5 或 |r| >0.3）（圖 3b）。這證明了 GRaMM 可以確定更多的關係對，數據預處理和混雜因子調整對結果重要。

使用 RDatabase2，Spearman 和 GRaMM 分析發現：基於 |r|>0.5 和 p<0.05 標準，確定 38 個相關對，14個為共有相關對（圖 3c）；GRaMM 的 R 值高於 Spearman（圖 3d）；10 個 Spearman 特有的關係對可能是由混雜因子導致的；14 個 GRaMM 特有的關係對可能是由非線性關係導致的（圖 3e）；兩種方法得到的TDCA~ Staphylococcus spp. 關係對結果的不同可能是由於 3 個異常值，GRaMM 混雜因子矯正之後，數據更分散以及相關性不同導致的（圖 3f-g）； 兩種方法得到的 GCA~ Bacillus cereus 關係對結果的不同可能是混雜因子導致的（圖 3h-i）； 兩種方法得到的 alpha-MCA ~ Clostridium colinum 關係對結果的不同可能由於非線性關係導致（圖 3j-k）。

圖 3. RDataset1（a-b）和 RDataset2（c-k）的結果

4.GRaMM 的適用性

使用的4個真實數據集：

• RDatabase2：42隻小鼠的 18 種膽汁酸和 Firmicutes 門下的 42 個genus/species
• RDatabase3：12隻小鼠的 20 種膽汁酸和 Firmicutes 門下的 100 個genus/species
• RDatabase4：10 只小鼠的 39 種膽汁酸和 Firmicutes 門下的 65 個 genus/species
• RDatabase5：37 個人的 22 種膽汁酸和 Firmicutes 門下的 100 個 genus/species。

首先對代謝組數據做 log 轉換，微生物組數據做歸一化和 CLR 轉換。使用 4 個真實數據集，GRaMM 分析確定最相關的對（圖 4）。在所有數據集中，GRaMM 發現了3 個一致的 microbe–metabolite：Ruminococcus gnavus ~ ursodeoxycholic acid (UDCA)，Ruminococcus gnavus ~ chenodeoxycholic acid （CDCA）和 SMB53.spp ~ glycodeoxycholic acid (GDCA)。其中，先前研究中已經發現前兩個相關對，第三個相關對是新發現的。先前研究中發現：SMB53.spp 在T2D 小鼠中高豐度；高脂飲食小鼠中豐度降低。GDCA 是結合次級膽汁酸，營養吸收和各種細胞信號通路的調控分子，促進多囊性人膽管細胞的增殖，減少法尼醇X受體（FXR）的表達。FXR 是配體激活的核受體，調節肝膽汁酸的合成，轉運和分泌。這些證據支持這一關聯，但是需要大量實驗來驗證這種關聯以及確定這個關聯的調節方向。

圖 4. 使用真實數據集，4 種方法確定顯著相關對的比率（p<0.05 和 FDR<0.05）

結論與討論

GRaMM 能比較集成地處理代謝組和微生物組關聯分析，能處理 數據預處理，相關模型選擇，矯正混雜因子，p 值矯正等，以確保得到可信的結果。但是，GRaMM 的結果仍需要進一步的數據和實驗驗證。

參考文獻

Liang, D. et al. Strategy for Intercorrelation Identification between Metabolome and Microbiome. Anal Chem 91, 14424-14432 (2019).

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撰稿 | Yanni 責編 | NSC

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