編譯：鍾嘉豪 劉航 魏韜（華南農業大學）
全球啤酒年消費量達19.6億歐元（截至2016年）。除了葡萄酒之外，啤酒是消費最多的發酵酒精飲料。釀造工藝經歷了5000多年的發展，從1516年德國純度法頒布後的古代釀酒師發展到大規模的現代工業釀造。最新的發展，即精釀啤酒革命，拒絕了大型啤酒廠的趨勢，出現了大量更小、更多樣化的啤酒廠。啤酒花（Humulus lupulus L.）是實驗的主要焦點，是啤酒的決定性成分之一。除此之外，（大麥）麥芽、水和酵母是揮發性分子和非揮發性分子（稱為啤酒）的複雜水性混合物。小分子（<1000 Da）被稱為啤酒代謝物，在啤酒特性（如味道、香氣、酵母發酵、泡沫穩定性或啤酒老化）中起著重要作用。
在啤酒分析中，傅立葉變換離子迴旋共振(FTICR)質譜是一種很有前途的質譜方法。Gougeon等人已經通過與FTICR儀器耦合的直接流動注射esi方法描述了葡萄酒的化學空間。研究表明，這種方法在短時間內可以分解數千個分子，而不是數百個分子。事實上，Fourier 變換質譜技術是有關質量精度和分位功率的最先進的質量分析儀。無與倫比的質量解析度可實現流量噴射分析方法，從而獲得寬極性範圍的化合物。由於超高解析度（在 m /z 400 時功率為 500000 re. ）和精確質量測量 （±0.1 ppm），FTICR-MS 可以分離每個信號並分配分子公式，從而提供有關這些通常未知分析物的（生物）化學類的信息。 由於可以描述數千個要素，因此它提供了有關分析樣本的通用信息，否則這些樣本仍然隱藏。此外，通過質量差分網絡連接標記物質並在範克雷維倫圖中顯示化學成分的模式，可以推斷標記的組成性質。這些可視化方法使我們能夠對分子組做出持續良好的假設，從而區分不同的樣本。因此，可以識別並分配未知樣品的已公開的代謝特徵。具體成分是某些代謝特徵的特徵，可以通過快速和整體的FTICR測量的統計評估來感知。然而，FIA-FTICR-MS缺乏關於異構體和具體分子結構的信息，這需要第二種分析技術。Tandem UHPLC-ToF-MS 能夠解析異構化合物並提供更深入的結構信息。根據 FTICR 中的確切m/z值，專用化合物和異構體的碎片能夠識別結構層面上最重要的分子。提出的方法填補了大量分析特徵的可用性、其組成注釋和深層結構信息之間的差距。它為確認代謝特徵和深入搜索獨特的隱藏代謝物打開了應用程式。
分子複雜性的可視化
為了探索每種啤酒的成分多樣性和分子複雜性，通過流量注入ESI（+）FTICR-MS對樣品進行了分析。啤酒的化學空間多種多樣，因為各種不同原料及其在釀造過程中處理，包括麥芽、烘烤、煮沸、發酵和過濾。例如，圖1顯示了皮爾斯納啤酒的光譜。宏觀一般視圖（圖1a）顯示了（寡頭）糖化模式的亞化。然而，單個標稱質量（圖1b）的詳細視圖顯示，質量為391的高達27m/z值，該值可分配給平均誤差為<0.1 ppm（電子質量的正差為<1/10）的分子公式。啤酒樣品的分子種類，從肽[C19H28N4O5]，碳水化合物[C13H24O11]，脂肪酸[C21H40O4]通過它們的硫酸鹽[C18H31O7S]到潛在美拉德反應產物的同位素，如脫氧果糖(iso-)leucine [13C1C11H23NO7]。可以通過高解析度的FTICR測量顯示在一個標稱質量。總共在每個啤酒光譜中平均有2800種成分。考慮到一個給定的公式存在不同的異構體，光譜摘錄中的27個分子式代表了普通資料庫中從0到11個異構體的68個匹配。因此，單個啤酒的FIA-FTICR-MS光譜可以被認為是數千種不同濃度的化合物的瞬時概覽。所有m / z值分配給一個分子式和出現在至少5%的啤酒樣品中描述二維van Krevelen圖(圖2)。從而群眾可以聯繫到化學家庭喜歡碳水化合物、多肽、有機酸、酚類、脂類、核苷酸甚至啤酒花苦酸及其對應的derivatives29。在van Krevelen圖中繪製了超過95%的啤酒光譜中存在的350個公式，我們可以發現，啤酒矩陣似乎是由碳水化合物和衍生物、肽，以及啤酒花苦味酸定義的。與此相反，脂類和酚類化合物更特定於單一啤酒或組啤酒(補充圖1)。
圖1：FTICR-MS光譜揭示了皮爾斯納啤酒的化學性及其中的生化模式。
全尺寸視圖(a)顯示己糖縮合模式和名義質量m/z 391 ，(b)的摘錄說明了啤酒在單一名義質量內解決的化學多樣性。在質量峰值上給出了附加的和公式和質量誤差。求和公式的色標:CHO藍色;CHNO橙色;CHOS綠色;CHNOS紅色。加合物的形成分別表示為磷酸二氫的+H2PO4和氯化物的+Cl。
圖2：Van Krevelen圖（H/C與O/C）的啤酒成分顯示了其多樣性和相關化合物類別。
至少在5%的啤酒樣本中顯示了注釋。特定於某些複合類的區域用虛線標記。顏色代碼：CHNO 藍色;CHNO 橙色;CHOS 綠色;CHNOS 紅色;P 紫羅蘭;Cl 淺紫羅蘭色。氣泡大小表示平均相對強度。
通過在質量差值網絡中顯示分配的元素公式可以利用FTICR-MS提供的精確質量信息，將CHO、CHNO、CHNOS、CHOS和P化學空間設定為關係。圖3a顯示，含硫空間與高度連接的CHO/CHNO球體分離。磷酸鹽的分子也是如此，這些分子大多通過甘油磷酸鹽、磷氨基胺、六磷酸酯和磷酸化本身與其他空間相連。主要與胺基酸反應的質量差異在CHNO化學空間內和CHO和CHNO空間之間（±50%）中最佔優勢。己糖和戊糖的縮合是最豐富的糖相關反應，連接(低聚糖)糖與它們專用的苷元。除了核酸和甘油的縮合外，還可以發現一些更具體的代謝途徑的反應，如丙烯醯化(萜類)。總的來說，與原料相關的化學反應(焙燒/麥芽化/沸騰)與生物化學驅動的反應(原料/發酵)是相同的。在圖3b中可以找到單個修改頻率的提取。
圖3：啤酒樣品註解的質量差網絡及其（生物）化學連通性。
氯加合物在矽中轉化成它們專用的[M-H]離子。色標對比圖2。標記啤酒花苦味酸衍生物在質差網絡(a)內的面積。以下是(生物)化學反應的摘錄，包括它們的質量和差異和它們在網絡中出現的頻率(b)。
多變量分析
層次聚類分析(HCA)顯示一個總體概述不同樣本的相似性的發現一群典型的啤酒啤酒樣品(圖4)。質量控制樣品,即整除的同一個啤酒啤酒,是正確位於這個群和建立一個自己的子群,這表明這個啤酒的指紋通過不同的批次是守恆的。含有烤麥芽、燕麥、無麩質穀物等特殊穀物的啤酒，還有小麥啤酒和無酒精啤酒。除了這些啤酒群，還有一個主要但不完全由精釀啤酒和比利時特製啤酒組成的集團。一些更傳統的啤酒也被分配到這個組中，可能是由於特定分子模式的重疊。對樹狀圖的詳細檢查顯示了來自一個啤酒廠的兩對啤酒(下面以「啤酒廠A」命名)——即啤酒廠A的窖藏啤酒和小麥啤酒及其相應的無酒精版本。這些對反映了該啤酒廠的脫醇過程主要是原含醇啤酒的下吸式蒸發過程。釀造過程本身保持不變，這使得這些啤酒非常相似。
圖4：:層次聚類將啤酒樣品的FTICR質譜按啤酒類型進行排列。
觀察集群的顏色代碼：啤酒藍色;用特殊穀物紅釀造的啤酒;小麥啤酒綠色;精釀啤酒黃色;無酒精啤酒淺藍色。將QC啤酒樣品組框起來。放大的摘錄顯示了一個釀造場的含酒精和不含酒精的啤酒的集群。
實驗顯示了高場 Fourier 變換離子回旋加速器質譜儀的使用，用於對各種啤酒樣品進行非靶向代謝分析，並且由於提供的超高解析度，可實現流量噴射分析。這能夠展示卓越的質量精度與組合網絡中的注釋配對的好處。構建組合質量差網絡利用FTICR-MS提供的精確質量信息，使複雜公式和整個構圖空間得以覆蓋。
作為小麥穀物作為啤酒中標記物質衍生的二級代謝物，其發生強調了分析方法的整體性和深層性。羥基苯甲酮（HBOA）及其衍生物已知是小麥植物中具有抗真菌、抗菌和殺蟲劑特性的植物素——血黃素儲存在氣穴中，通過細胞損傷後通過β糖酶活性激活。可以預期，所述硫酸鹽在植物素的儲存或運輸中發揮作用。先前表明，植物素在食品加工和發酵過程中經過改良。因此，麥芽和煮沸期間的化學反應也可能導致小麥和啤酒基質中未知的多種可能衍生物。組成網絡即使在啤酒基質中也提供了獲得新代謝物的機會，這使得在小麥植物、穀物或其隔間內採用類似方法尤其有希望。值得一提的是，在FTICR和LC-ToF-MS的測量中，僅使用小麥澱粉釀造的啤酒中找不到小麥代謝物的特徵。這些啤酒缺乏小麥粒的二級代謝。這裡介紹的分析和統計技術的結合，提出了在釀造科學與工業方面尚未提出的問題方面取得重大進展的潛力。FIA-FTICR-MS提供的啤酒類型和穀物的代謝特性，可以通過分別鑑定18種（2級）和118（3級）化合物來驗證，以鑑定豐富的跳躍和使用小麥。從前景中，用小麥釀造的啤酒和僅用小麥澱粉釀造的啤酒之間的差別顯示了超高解析度在食品檢驗或質量控制應用方面的潛力。正在進行的工作側重於花費其他描述性參數的方法和呈現代謝特徵的考古學應用。對葡萄酒和啤酒的考古化學調查通常由 GC+MS 執行和基於紅外測量或僅限於目標方法將來提出的代謝特徵將有利於對早期現代的古代啤酒飲料和啤酒進行深入剖析。
原文連結：
https://www.nature.com/articles/s41538-020-00070-3
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