一、實驗目的
1.學會使用移液器。
2.熟悉細胞培養過程中的無菌操作技術。
3.掌握細胞傳代培養的基本方法。
4.掌握貼壁生長細胞的一般形態和生長狀態。
二、實驗原理
1、細胞培養的概念
細胞培養是指在體外模擬體內的生理環境，培養從機體中取出的細胞，並使之生存和生長。體外培養包括器官培養、組織培養和細胞培養(cell culture)。
2、細胞培養技術的優點
由於人工培養條件易於改變並能嚴格控制和能進行單因素分析，所以便於用各種物理的、化學的或生物的外界因素來研究細胞生命活動的規律；由於細胞處於體外培養環境中，便於用各種技術方法研究和觀察細胞結構和功能的變化；由於細胞在體外培養環境中可以長期地存活和傳代，因而便於研究和觀察細胞遺傳性的改變；可以比較經濟地、大量地提供生物性狀相同的細胞作為研究對象。
3、局限性：主要是細胞離體以後失去與其周圍環境的密切聯繫，其細胞生物學性質必然會發生某些改變，這是應用細胞培養技術時應該充分注意到的問題。
4、細胞培養的條件
●營養物質：糖、胺基酸和維生素三大類
●環境：無菌環境、溫度、氣體、酸鹼度、 滲透壓、 培養底物或介質。
●廢物的排出
5、無菌操作技術
●培養用品的清洗消毒
●超淨工作檯的消毒
●操作過程中的消毒
●手的消毒
6、傳代培養：將細胞從一個培養瓶轉移或移植到另一個培養瓶即稱為傳代培養(passage)。
三、試劑與器材
1.材料：LN299人膠質瘤細胞系。
2.試劑：培養液（含10%胎牛血清）、胰蛋白酶液、PBS、酒精等。
3.器材：二氧化碳培養箱、恆溫水浴箱、倒置顯微鏡、移液器、培養瓶、培養板、吸管、膠帽、青黴素小瓶、眼科鑷子、飯盒等。
四、實驗方法
1.觀察。 細胞是否形成緻密單層。
2.PBS衝洗。去除殘留血清及死亡細胞。
3.消化。向培養瓶中加入適量0.25%胰蛋白酶-EDTA混合液，使細胞均浸入消化液。
4.倒置顯微鏡下觀察，細胞變圓，棄去消化液，加入血清培養液終止消化，吸管吹打，形成細胞懸液，轉入離心管。
5.接種至96孔板，每孔200 ul。
6.標記。
7.培養。
五、注意事項
1.所有的操作都應該在超淨工作檯中酒精燈火焰的旁邊進行。
2.開蓋培養液或培養用品應儘量保持傾斜或水平。
3.吸取不同的液體要換用不同的吸管。
4.操作過程中，動作要敏捷，不能用手觸及器皿的消毒部位。
5.消化時要先加蓋才能拿出去。
六、作業與思考
1.寫出細胞傳代培養的實驗記錄。
2.在細胞培養過程中，培養液的顏色為什麼會變黃？
①細胞生長旺盛，代謝活躍，產生大量乳酸和CO2。
②緩衝體系不足（如果是在CO2培養箱中，擰得太松，緩衝不強的話確實有這個問題）
3.在細胞培養的過程中避免汙染的關鍵環節有哪些？
（1）接種時在近火焰處打開瓶口，使瓶傾斜，以免空氣中微生物落入瓶中。
（2）整個接種操作應在近火焰處進行，且動作要迅速。
（3）防止操作帶來的汙染，接種過程中儘可能達到懸空要求。
（4）接種時不得用手接觸瓶蓋內壁或瓶口。
（5）瓶蓋朝上放，接種完畢後立即蓋好瓶蓋。
（6）接種完一瓶用火燒用具以防止交叉汙染產生。
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