色譜定量分析,顧名思義就是色譜分析方法來測定組分的含量,主要分為面積百分比法、歸一化法、外標法、內標法和標準加入法,色譜定量分析首先需要明確的概念是響應因子,不同的化合物在檢測器的響應是不一樣的,簡單地舉個例子說,相同濃度的化合物A和B,相同的進樣量,得到的峰高和峰面積不一定一樣的,響應因子的計算式如下:
式中,w為化合物的含量,A為響應值,一般為峰面積或峰高,本文以峰面積為例。由於不同的化合物在同一個檢測器的響應因子不同,甚至同一個化合物不同濃度在同一檢測器的響應因子不同,簡單地說就是化合物在檢測器的響應不呈線性,或者線性範圍比較窄。選擇合適的定量方法時,除需要考慮是相對定量還是絕對定量外,同時需要考察化合物的線性響應範圍、是否有合適內標、是否有標準品等。本文簡單介紹下色譜分析中常用的一些定量方法。
1. 歸一化法:
把所有出峰的組分含量之和按100%計算的定量方法,其中組分i的質量分數可按下式計算:
式中,f為響應因子,A為峰面積,w為含量
歸一化法屬於相對定量,優點是簡便、準確,進樣量、流速、柱溫等操作條件對定量結果的影響小,但要求所有組分都流出色譜柱,並被檢測器檢出,同時需要測定各個組分的響應因子,而各個組分的響應因子的測定都需要基準物質,所以使用受到限制。歸一化法主要用於GC,因為GC的一些檢測器如FID對某些組分的響應因子相近或有一定的規律,可以在文獻上查到,當響應因子相近時,可以直接用面積歸一化法。
2.峰面積百分比法:
峰面積百分比法也是相對定量,忽略各個組分的響應因子或者默認為每個組分的響應因子相同,計算如下式:
峰面積百分比法適合於不需要準確定量,同時難以得到響應因子的情況。
3.外標法:
外標法有標準曲線和單點外標法,標準曲線法是用標準品配製一系列濃度的標準溶液樣品,通過不同濃度的標準溶液及其對應響應值,繪製樣品濃度和響應值關係曲線:
將待測組分的響應值帶入工作曲線可以計算組分的含量。
單點外標也叫標準品比對法,是將原點和標準溶液的數據連成一條直線,如下式的計算:
式中,Ci為待測組分含量,Ai為待測組分的峰面積,Astd為標準溶液中標準物的峰面積,Cstd為標準溶液濃度。
外標法屬於絕對定量,繪製好標準曲線後,測定該組分的峰面積或峰高后,代入標準曲線就可以計算得到含量,待測組分含量應該是在標準曲線濃度範圍內的,HPLC定量比較多使用外標法,外標法需要每次樣品分析的色譜條件儘量一致,否則需要重新測定標準曲線樣品得到新的標準曲線。一般一個分析批至少需要一條標準曲線,生物樣品分析時除需要考察標準曲線線性範圍、分析準確度和精密度外,還需要考察一個分析批能夠耐受的樣品數量,即在一個分析批內多少樣品數量範圍內定量是準確的。
4.內標法:
內標法是選擇合適的化合物作為待測組分的參比物,定量地加到樣品中,根據待測組分和內標的響應值(峰面積或峰高)之比,以及內標物的含量來計算待測組分的含量。
式中,fi和fIS分別為待測組分和內標的響應因子,Ai和AIS為待測組分和內標的響應值,wi和wIS分別為待測組分含量和內標含量。
這種方法需要測定待測物和內標物的響應因子,常用於GC中。另一種內標比對法是常用於LCMS/MS中,內標比對法是在不知道響應因子的情況下的一種內標法,先將一定量的內標物加入到標準物溶液中,再將相同量的內標加入到待測溶液中,分別進樣,按下式計算待測組分含量:
式中,Ci為待測組分含量,Ai為待測組分的峰面積,Astd為標準溶液中標準物的峰面積,Cstd為標準溶液濃度,AIS為內標的峰面積。。
內標物的選擇是內標法的關鍵,內標物應滿足以下幾點:
內標法的優點是:進樣量的變化,色譜條件的微小變化對定量結果的影響不大,同時也可以校正樣品前處理(提取、濃縮、衍生化等)過程中樣品的損失。如果可以選擇合適的內標,內標法定量的準確度和精密度是優於外標法的。
5.標準加入法:
標準加入法實質上是一種特殊的內標法,是以待測組分的純物質作為內標,加入到待測樣品中,然後在相同的色譜條件下,測定加入前後待測組分的峰面積(或峰高),從而計算出樣品中待測組分的含量。以峰面積計算方法為例,標準加入法的計算如下:
式中,Δwi為加入的標準品的量,Ai為待測組分的峰面積,ΔAi為加入標準品後待測組分峰面積的增加量,wi為原樣品中待測組分的含量。
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