第四節 螢光顯微鏡檢查法
一、螢光顯微鏡
螢光顯微鏡是免疫螢光細胞化學的基本工具。它是由光源、濾板系統和光學系統等主要部件組成。是利用一定波長的光激發標本發射螢光，通過物鏡和目鏡系統放大以觀察標本的螢光圖像（圖3-15）。
圖3-15 螢光顯微鏡的結構和主要部件
（一）光源
現在多採用200W的超高壓汞燈作光源，它是用石英玻璃製作，中間呈球形，內充一定數量的汞，工作時由兩個電極間放電，引起水銀蒸發，球內氣壓迅速升高，當水銀完全蒸發時，可達50～70個標準大氣壓力，這一過程一般約需5～15min。超高壓汞燈的發光是電極間放電使水銀分子不斷解離和還原過程中發射光量子的結果。它發射很強的紫外和藍紫光，足以激發各類螢光物質，因此，為螢光顯微鏡普遍採用。
超高壓汞燈也散發大量熱能。因此，燈室必須有良好的散熱條件，工作環境溫度不宜太高。
新型超高壓汞燈在使用初期不需高電壓即可引燃，使用一些時間後，則需要高壓啟動（約為15000V），啟動後，維持工作電壓一般為50～60V，工作電流約4A左右。200W超高壓汞燈的平均壽命，在每次使用2h的情況下約為200h，開動一次工作時間愈短，則壽命愈短，如開一次只工作20min，則壽命降低50%。因此，使用時儘量減少啟動次數。燈泡在使用過程中，其光效是逐漸降低的。燈熄滅後要等待冷卻才能重新啟動。點燃燈泡後不可立即關閉，以免水銀蒸發不完全而損壞電極，一般需要等15min。由於超高壓汞燈壓力很高，紫外線強烈，因此燈泡必須置燈室中方可點燃，以免傷害眼睛和發生爆炸時造成操作。
超高壓汞燈（100W或200W）光源的電路和包括變壓、鎮流、啟動幾個部分。在燈室上有調節 燈泡發光中心的系統，燈泡球部後面安裝有鍍鋁的凹面反射鏡，前面安裝有集光透鏡。
國產超高壓汞燈GCQ-200型性能良好，可以代替HBO-200等型的進口燈泡，平均壽命在200h以上，價格也比較低。
我國研製的一種簡易輕便型高色溫溴鎢螢光光源裝置，體積小，重量輕，功率小，交、直流兩用（自帶直流電源），易於攜帶，使用方便，已推廣應用。
（二）濾色系統
濾色系統是螢光顯微鏡的重要部位，由激發濾板和壓制濾板組成。濾板型號，各廠家名稱常不統一。濾板一般都以基本色調命名，前面字母代表色調，後面字母代表玻璃，數字代表型號特點。如德國產品（Schott）BG12，就是種藍色玻璃，B是藍色的第一個字母，G是玻璃的第一個字母；我國產品的名稱已統一用拼音字母表示，如相當於BG12的藍色濾板名為QB24，Q是青色（藍色）拼音的第一個字母，B是玻璃拼音的第一個字母。不過有的濾板也可以透光分界濾長命名，如K530，就是表示壓制濾長530nm以下的光而透過530nm以上的光。還有的廠家的濾板完全以數字命名，如美國Corning廠的NO：5-58，即相當於BG12。
用於螢光顯微鏡的主要濾板如表3-1。
表3-1 螢光顯微鏡常用濾板型號和透光特點
基本色調 相應名稱 2mm厚透光範圍（峰值）nm 上海電器元件廠 德國（Schott） 蘇聯 日本 黑紫 ZWB-1 UG-1 yΦC-2 DV-1 300～400（365） 黑紫 ZWB-2 UG-5 yΦC-1 280～240（360） 靛藍 ZB-2 BG-1 ΦC-1 BG-1 300～500（380） 靛藍 ZB-3 BG-3 CC-4 BG-3 260～520（400） 靛藍 QB-24 BG-12 CC-8 BG-12 310～570（420） 淡藍 QB-10 BG-38 C3C-5 310～720（460） QB-12 -8 -11 橙黃 CB-3 OG-1（K530） OC-11 OG-1 530以上 橙黃 JB-8 OG-4（K510） ЖC-18 FY-5 510以上 綠橙 JB-7 GG-11（K490） ЖC-17 FY-3 480以上 FY-4 淡綠 JB-4 GG-3（K430） жC-11 US-10 420以上
引自：五九一節 五部隊編：螢光顯微術，見參考資料）
1．激發濾板 根據光源和螢光色素的特點，可選用以下三類激發濾板，提供一定波長範圍的激發光。
紫外光激發濾板：此濾板可使400nm以下的紫外光透過，阻擋400nm以上的可見光通過。常用型號為UG-1或UG-5，外加一塊BG-38，以除去紅色尾波。
紫外藍光激發濾板：此濾板可使300～450nm範圍內的光通過。常用型號為ZB-2或ZB-3，外加BG-38。
紫藍光激發濾板：它可使350～490nm的光通過。常用型號為QB24（BG12）。
最大吸收峰在500nm以上者的螢光素（如羅達明色素）可用藍綠濾板（如B-7）激發。
近年開始採用金屬膜幹涉濾板，由於針對性強，波長適當，因而激發效果比較玻璃濾更好。如西德Leitz廠的FITC專用KP490濾板和羅達明的S546綠色濾板，均遠比玻璃濾板效果好。
激發濾板分薄厚兩種，一般暗視野選用薄濾板，亮視野螢光顯微鏡可選用厚一些。基本要求是以獲得最明亮的螢光和最好的背景為準。
2．壓制濾板 壓制濾板的作用是完全阻擋激發光通過，提供相應濾長範圍的螢光。與激發濾板相對應，常用以下3種壓制濾板：
紫外光壓制濾板：可通過可見光、阻擋紫外光通過。能與UG-1或UG-5組合。常用GG-3K430或GG-6K460。
紫藍光壓制濾板：能通過510nm以上濾長的螢光（綠到紅），能與BG-12組合。通常用OG-4K510或OG-1K530。
紫外紫光壓制濾板：能通過460nm以上波長的螢光（藍到紅），可與BG-3組合，常用OG-11K470AK 490，K510。
（三）反光鏡
反光鏡的反光層一般是鍍鋁的，因為鋁對紫外光和可見光的藍紫區吸收少，反射達90%以上，而銀的反射只有70%；一般使用平面反光鏡。
（四）聚光鏡
專為螢光顯微鏡設計製作的聚光器是用石英玻璃或其他透紫外光的玻璃製成。分明視野聚光器的暗視野聚光器兩種。還有相差螢光聚光器。
1．明視野聚光器 在一般螢光顯微鏡上多用明視野聚光器，它具有聚光力強，使用方便，特別適於低、中倍放大的標本觀察。
2．暗視野聚光器 暗視野聚光器在螢光顯微鏡中的應用日益廣泛。因為激發光不直接進入物鏡，因而除散射光外，激發光也不進入目鏡，可以使用薄的激發濾板，增強激發光的強度，壓制濾板也可以很薄，因紫外光激發時，可用無色濾板（不透過紫外）而仍然產生黑暗的背景。從而增強了螢光圖像的亮度和反襯度，提高了圖像的質量，觀察舒適，可能發現亮視野難以分辨的細微螢光顆粒。
3．相差螢光聚光器 相差聚光器與相差物鏡配合使用，可同時進行相差和螢光聯合觀察，既能看到螢光圖像，又能看到相差圖像，有助於螢光的定位準確。一般螢光觀察很少需要這種聚光器。
（五）物鏡
各種物鏡均可應用，但最好用消色差的物鏡，因其自體螢光極微且透光性能（波長範圍）適合於螢光。由於圖像在顯微鏡視野中的螢光亮度與物鏡鏡口率的平方成正比，而與其放大倍數成反比，所以為了提高螢光圖像的亮度，應使用鏡口率大的物鏡。尤其在高倍放大 時其影響非常明顯。因此對螢光不夠強的標本，應使用鏡口率大的物鏡，配合以儘可能低的目鏡（4×,5×，6.3×等）。
（六）目鏡
在螢光顯微鏡中多用低倍目鏡，如5×和6.3×。過去多用單筒目鏡，因為其亮度比雙筒目鏡高一倍以上，但目前研究型螢光顯微鏡多用雙筒目鏡，觀察很方便。
（七）落射光裝置
新型的落射光裝置是從光源來的光射到幹涉分光濾鏡後，波長短的部分（紫外和紫藍）由於濾鏡上鍍膜的性質而反射，當濾鏡對向光源呈45。傾斜時，則垂直射向物鏡，經物鏡射向標本，使標本受到激發，這時物鏡直接起聚光器的作用。同時，濾長長的部分（綠、黃、紅等），對濾鏡是可透的，因此，不向物鏡方向反射，濾鏡起了激發濾板作用，由於標本的螢光處在可見光長波區，可透過濾鏡而到達目鏡觀察，螢光圖像的亮度隨著放大倍數增大而提高，在高放大時比透射光源強。它除具有透射式光源的功能外，更適用於不透明及半透明標本，如厚片、濾膜、菌落、組織培養標本等的直接觀察。近年研製的新型螢光顯微鏡多採用落射光裝置，稱之為落射螢光顯微鏡。
二、螢光顯微鏡標本製作要求
（一）載玻片
載玻片厚度應在0.8～1.2mm之間，太厚的坡片，一方面光吸收多，另一方面不能使激發光在標本上聚集。載玻片必須光潔，厚度均勻，無明顯自發螢光。有時需用石英玻璃載玻片。
（二）蓋玻片
蓋玻片厚度在0.17mm左右，光潔。為了加強激發光，也可用幹涉蓋玻片，這是一種特製的表面鍍有若干層對不同波長的光起不同幹涉作用的物質（如氟化鎂）的蓋玻片，它可以使螢光順利通過，而反射激發光，這種反射的激發光女可激發標本。
（三）標本
組織切片或其他標本不能太厚，如太厚激發光大部分消耗在標本下部，而物鏡直接觀察到的上部不充分激發。另外，細胞重迭或雜質掩蓋，影響判斷。
（四）封裱劑
封裱劑常用甘油，必須無自發螢光，無色透明，螢光的亮度在pH8.5～9.5時較亮，不易很快褪去。所以，常用甘油和0.5mol/l pH9.0～9.5的碳酸鹽緩衝液的等量混合液作封裱劑。
（五）鏡油
一般暗視野螢光顯微鏡和用油鏡觀察標本時，必須使用鏡油，最好使用特製的無螢光鏡油，也可用上述甘油代替，液體石蠟也可用，只是折光率較低，對圖像質量略有影響。
三、使用螢光顯微鏡的注意事項
（1）嚴格按照螢光顯微鏡出廠說明書要求進行操作，不要隨意改變程序。
（2）應在暗室中進行檢查。進入暗室後，接上電源，點燃超高壓汞燈5～15min，待光源發出強光穩定後，眼睛完全適應暗室，再開始觀察標本。
（3）防止紫外線對眼睛的損害，在調整光源時應戴上防護眼鏡。
（4）檢查時間每次以1～2h為宜，超過90min，超高壓汞燈發光強度逐漸下降，螢光減弱；標本受紫外線照射3～5min後，螢光也明顯減弱；所以，最多不得超過2～3h。
（5）螢光顯微鏡光源壽命有限，標本應集中檢查，以節 省時間，保護光源。天熱時，應加電扇散熱降溫，新換燈泡應從開始就記錄使用時間。燈熄滅後欲再用時，須待燈泡充分冷卻後才能點燃。一天中應避免數次點燃光源。
（6）標本染色後立即觀察，因時間久了螢光會逐漸減弱。若將標本放在聚乙烯塑膠袋中4℃保存，可延緩螢光減弱時間，防止封裱劑蒸發。
（7）螢光亮度的判斷標準：一般分為四級，即「一」—無或可見微弱螢光。「+」—僅能見明確可見的螢光。「++」—可見有明亮的螢光。「+++」—可見耀眼的螢光。
四、螢光圖像的記錄方法
螢光顯微鏡所看到的螢光圖像，一是具有形態學特徵，二是具有螢光的顏色和亮度，在判斷結果時，必須將二者結合起來綜合判斷。結果記錄根據主觀指標，即憑工作者目力觀察。作為一般定性觀察，基本上可靠的。隨著技術科學的發展，在不同程度上採用客觀指標記錄判斷結果，如用細胞分光光度計，圖像分析儀等儀器。但這些儀器記錄的結果，也必須結合主觀的判斷。
螢光顯微鏡攝影技術對於記錄螢光圖像十分必要，由於螢光很易褪色減弱，要即時攝影記錄結果。方法與普通顯微攝影技術基本相同。只是需要採用高速感光膠片如ASA200以上或24。以上。因紫外光對螢光猝滅作用大，如FITC的標記物，在紫外光下照射30s，螢光亮度降低50%。所以，曝光速度太慢，就不能將螢光圖像拍攝下來。一般研究型螢光顯微鏡都有半自動或全自動顯微攝影系統裝置。