數字PCR在乳腺癌預防及診斷中的應用

2020-12-15 生物谷

乳腺癌是女性排名第一位的常見惡性腫瘤。2011年美國CA: A Cancer Journal for Clinicians雜誌公布的最新統計數據顯示，美國2011年預計將有超過23萬女性罹患乳腺癌，佔女性新發惡性腫瘤的30%。其中15%-25%的乳腺癌患者顯示為HER-2基因過表達。

HER-2/neu（又稱c-erbB-2）基因為表皮生長因子受體家族成員之一，是一種原癌基因，研究表明，HER-2/neu基因擴增或過表達的乳腺癌患者易早期復發且生存期縮短。檢測HER-2基因是否高表達對於患者的預後判斷、治療方案的選擇具有重要意義,HER-2是乳腺癌明確的預後指標和藥物治療效果的預測指標。

目前，《乳腺癌HER2檢測指南(2011版)》仍推薦IHC與FISH和(或)CISH相結合的檢測策略。IHC操作簡便，實驗成本低，但是其分析結果是主觀的，可變的，不同的抗體和不同的實驗人員都可能引發結果的不確定性，檢測結果受樣本要求及缺乏判斷標準等；而CISH在研究數據支持方面則遠不如IHC與FISH。因此，以HER-2位點特異性螢光原位雜交探針為基礎的FISH方法仍被認為是"金標準"來判斷HER-2在DNA水平上的擴增結果，尤其對低度擴增的檢測更為重要。FISH檢測耗時長，操作步驟繁瑣，實驗結果的判讀過分依賴於實驗人員的經驗，而且臨床研究中發現FISH檢測也存在一定的局限性。

為了提高HER-2檢測的精確性及檢測通量，有很多實驗室開始使用qPCR平臺進行HER-2定量分析及拷貝數變異分析，但是這種方式屬於相對定量分析，精確性有限，不能有效區分微小的基因表達變化和拷貝數變異，尤其是對於異質樣本來說更為困難。

商業化數字PCR平臺的出現，為提高HER-2檢測的準確性提供了很好的解決方案。QX100微滴式數字PCR系統採用創新的微滴化技術，將含有DNA或RNA的PCR反應體系分成約20,000個微滴。經PCR擴增後，逐個對每個微反應進行檢測，有螢光信號的微滴判讀為1，沒有螢光信號的微滴判讀為0，根據泊松分布原理及陽性微滴的個數與比例即可得出靶分子的起始拷貝數或濃度。

密西西比大學醫學中心和Bio-Rad Digital Biology Center的科學家們發現使用QX100微滴式數字PCR平臺可以對HER-2基因的表達水平及基因組拷貝數變異進行精準的定量分析。圖1顯示在使用新鮮凍存的樣本為實驗材料，對其cDNA進行2倍濃度稀釋後，以GAPDH作為參照基因，對HER-2基因的表達水平進行分析。圖中結果清晰顯示使用雙重體系檢測的濃度梯度具有很好的線性關係，而且使用GAPDH校正後的基因比例一致性。同時，該文獻還指出，使用EEF2作為內參基因，對相同的實驗體系進行HER-2基因表達分析獲得了類似的實驗結果。

圖1.HER2RNA水平濃度檢測的線性分析

樣本為Origene公司的新鮮凍存樣本CR561507cDNA2倍濃度梯度稀釋，使用雙重反應體系，HER-2（FAM標記，圖中藍色方塊顯示），GAPDH（VIC標記，圖中綠色方塊顯示）。經GAPDH校正後的HER2濃度顯示為紅褐色的圓圈。每個點的誤差線標示95%的置信區間。

更進一步地，針對臨床樣本HER-2基因拷貝數變異分析的研究中，不同的實驗室也得到了類似的實驗結果。在針對39例臨床樣本的ddPCR分析中，ddPCR結果顯示其中的10例樣本HER-2基因組拷貝數大於4.4，顯示為HER-2陽性。剩餘29例為HER-2陰性，HER-2基因組拷貝數為1.6-3。這個結果與之前IHC和FISH的結果完全一致。

以上這些實驗結果都表明，ddPCR可以作為HER-2基因拷貝數分析的有力工具，無論是DNA水平，還是RNA水平的拷貝數變化，都可以通過QX100準確獲悉。而且，針對目前臨床使用較多的技術，FISH和IHC這類顯微觀察為基礎的技術操作步驟繁瑣，實驗結果的判讀過分依賴於實驗人員的經驗。有臨床數據發現17號染色體擴增導致HER-2基因表達增加可引起HER-2蛋白過表達（IHC3+）與HER-2基因擴增（FISH+）不一致的情況，FISH檢測結果存在一定的不足之處。數字PCR的出現，為臨床HER-2診斷提供了很好的科研思路和診斷策略。

與此同時，我們還發現，有一些科學家開始使用QX100微滴式數字PCR平臺進行乳腺癌預防相關的前瞻性研究。最新的一篇QX100相關文獻報導了日本科學家關於體細胞拷貝數變異與乳腺癌易感性關聯的最新研究成果。在此篇文獻中，科學家通過患者組和正常組的比較基因組學雜交晶片篩選到一些乳腺癌相關的CNV，並通過QX100對其中的6個CNV位點進行了拷貝數驗證，通過相關的統計學分析發現，其中一部分CNVs與乳腺癌的易感性密切相關，這些CNVs位點可以作為乳腺癌風險預警的分子標誌。

綜上所述，方興未艾的數字PCR技術在乳腺癌預防及診斷中發揮著越來越重要的作用，在HER-2基因的表達水平和拷貝數分析的研究中，使用ddPCR可以對DNA和RNA中的HER-2基因進行精準定量，可以為乳腺癌的分子分型及診斷提供有力的幫助，ddPCR的實驗結果對於乳腺癌的治療及預後評估具有重大的指導意義。同時，在針對癌症早期預防和癌症易感性的前瞻性研究中，ddPCR平臺可以聯合高通量測序及比較基因組雜交晶片技術，對已篩選到的未知突變或者低豐度表達/變異基因進行準確的鑑定分析，與高通量篩選平臺互為印證，嚴謹、系統地闡述全新的科研成果。（生物谷 Bioon.com）

相關資料下載：

1. Droplet Digital PCR Quantitation of HER2 Expression in FFPE Breast Tissue Samples

2. Droplet Digital PCR Measurement ofHER2 Copy Number Alteration inFormalin-Fixed Paraffin-EmbeddedBreast Carcinoma Tissue

3. Germline Copy Number Variations Associated with Breast Cancer Susceptibility

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