肝細胞癌是世界上最致命的腫瘤之一，但目前選擇肝癌特異性藥物缺乏明確依據，腫瘤位點檢測又常因為其異質性受到影響，建立一個可靠的、可用的體外篩選模型至關重要，這也是該領域絕對熱點。北京協和醫院肝臟外科毛一雷教授團隊使用上普生物3D列印設備，首次成功構建了肝細胞癌個性化模型，並對4種常用的肝癌靶向藥物進行體外個體化篩選，取得了令人意想不到的結果。該研究Three-dimensional Bio-printing of Primary Human Hepatocellular Carcinoma for Personalized Medicine於近日發表在生物材料領域排名第一的期刊Biomaterials（IF=10.317）。
快速導讀
我們目前掌握的信息和技術有哪些？
肝癌是世界上最致命的腫瘤之一，我國是肝癌大國，肝癌患者佔世界一半。針對肝癌的經驗性靶向治療的效率較低，檢測位點也有很多不準確，急需一種體外穩定的、高效的針對特定患者的個性化癌症藥篩模型。原代人腫瘤細胞動物體內藥篩模型（PDX）已經建立很久了，最後不能實用是因為模型構建時間太久（數月）、成功率不高、而成本很高。幾乎沒有臨床實用性。類器官模型（Organoid）是全新的技術，但是缺陷明顯：成功率低（在20%，因為要靠腫瘤Ki67水平）、構建時間長（一般數周），對於病人原代HCC細胞的固有增殖能力依賴性強，價格昂貴。所以落地到臨床應用還有障礙。本研究有哪些突破？
全球首次使用原代肝細胞癌細胞進行體外3D列印，並構建出多個個體化模型，用於不同肝癌靶向藥物的個性化藥物篩選。3D列印原代肝細胞癌模型相比PDX和Organoid模型，構建時間大幅縮短（數小時vs. 2-3個月）；形狀和密度非常均勻並可調控；保留了肝癌的親本性；構建方法可靠性和穩定性很高，且不依賴與原代腫瘤的固有增殖能力，具有極大的優勢和潛力。並且成功進行了有意義的藥敏試驗。3D列印個性化肝癌藥篩模型的成功建立，提示了這種技術實際上可以不困難地拓展到人體的多種腫瘤，而不局限在肝癌。以後有希望將該技術用於多種腫瘤的個性化藥物篩選，在未來大規模藥物檢測和腫瘤病人個性化藥篩方面可能會有巨大的商業化應用價值。本文最後被錄用時，該領域頂尖專家審稿人情不自禁地對我們成果做出了額外的點評：The long-term culture and use of patient-derived HCC organoids in drug screenings is much more difficult than with commercial liver cancer cell lines。所有以往的熱門技術，成功率低且耗時長The take rate is low (less than 20% of cases) and typically requires over 2-3 months before an established line is useable for drug screens. 而毛等的報導方法卻達到了快速成瘤、高效的結果a method for achieving nearer term, more reliable patient-derived HCC ex vivo tumors for drug screening that could be done in less than a month. 這種方法顯然要比目前的類器官等更有優點While there are a lot of papers regarding HCC organoids with commercial cell lines, the reliability and time-frame in which ex vivo PRIMARY HCC tumors are grown here is impressive. 這個專家在說完這些以後，直接說文章就該發表，因為對於世界上正在該領域裡研究的各研究組都會有幫助或者促使他們思考轉換方向（也包括他自己的研究）As such, I strongly recommend publication as many other groups (including my own) would benefit from seeing this work and building on it
一般資深審稿人很少在稿件錄取以後對這個他審核的研究有這麼高的評價的。
致命腫瘤：肝細胞癌
肝癌是世界上最致命的腫瘤之一，肝細胞癌（Hepatocellular Carcinoma, HCC）是最常見的肝癌，佔該疾病的90％。目前，經驗性全身治療是晚期HCC患者的首選治療方法。然而，各種全身性藥物對晚期HCC患者的療效差異很大。侖伐替尼在所有一線或二線全身治療中均表現出最佳的客觀緩解率（ORR），但也只有24％，可見經驗性靶向治療的效率較低。
針對這一問題，我們需要穩定的針對特定患者的個性化體外癌症模型。目前常用的臨床前模型是PDX模型，但PDX模型建立成本高，成瘤率底，時間慢，所以這麼長時間都沒有落地在臨床應用；另一種模型是類器官模型（Organoid），目前仍然是最高光的研究成果，但是均勻尺寸和細胞數量的類器官形成過程不可控，且此方法依賴病人原代HCC細胞的固有增殖能力（Ki67），總體成功率不高，無法常規構建個性化類器官模型。
生物3D列印的出現和技術上快速的發展已經可以有效地解決這些問題，毛一雷教授課題組之前已經在GUT上發表成功列印具有功能的肝臟類器官（Hepatorganoid），並具有人肝的藥物代謝功能，還在一個肝衰的動物模型上顯著延長了動物生存時間（重磅：頂刊GUT | 3D列印功能性肝臟實現肝衰修復）；課題組還在這個技術平臺上成功構建了用於個性化藥物篩選的肝內膽管癌腫瘤模型（Biofabrication | 用於病人個性化藥物篩選的3D列印肝內膽管癌腫瘤模型）；而本次在以往的技術基礎上，進一步構建出穩定的、高效的人肝癌細胞的體外模型，並成功進行了多種藥篩。
3D列印個性化病人原代HCC模型
研究首次採用患者手術切除的HCC腫瘤樣本用於模型構建，研究者將患者原代HCC腫瘤細胞與明膠海藻酸鈉生物墨水（上普A1同源墨水）混合使用上普生物3D印表機列印成型。為了構建個性化模型，研究者提取了6名不同患者的HCC樣本來構建體外模型，並進行後續實驗。
3D列印構建體外模型簡單高效，HCC細胞消化分離後2小時即可完成構建。相比之下，類器官和PDX模型的形成需要幾個禮拜。並且，由於親本腫瘤增殖能力有限，類器官產生成功率僅有26％，有時甚至更低（20%以下），且形狀、細胞數量、密度均不可控。
3D列印個性化病人原代HCC模型的技術路線
3D列印HCC模型穩定可靠
通過對3D列印HCC模型進行特異性生物標誌物（AFP）表達的測試，研究者發現，全部六名患者的個性化模型，AFP表達測試的結果與患者表達一致。這說明3D列印HCC模型可以保留HCC細胞的特定生物標記。通過進一步進行外顯子組測序（WES），研究發現3D列印HCC模型與親本HCC組織的單核苷酸位點變異（SNV）保持高度一致性，並發現長期培養的模型很好的保留親本HCC組織的突變譜，尤其是HCC的關鍵突變。這說明3D列印HCC模型高度還原人類HCC的遺傳變異與表達譜，模型質量十分可靠。
3D列印HCC模型親本肝癌特徵檢測
3DP-HCC模型保留了原始腫瘤的遺傳改變和表達特徵為了了解長期培養的3DP-HCC模型中的細胞是否在體內保留了原始HCC的致瘤潛力和組織學特徵，研究者將3D列印HCC模型培養三周後分離出細胞，移植到小鼠皮膚下，並在小鼠受體中發現移植瘤。通過一系列實驗，研究者發現，原始HCC組織的典型細胞團結構在移植瘤中得到了很好的保留。並且，通過測定生物標誌物（AFP與Ki67），研究者發現移植瘤和父母HCC標本中均表達少量Ki-67，而PDX組織中AFP的表達明顯高於原始HCC標本，這在患者的正常肝組織中未發現，因此，3D列印HCC模型可以保留其致癌潛力和組織學特徵。
3D列印HCC模型異體移植
個性化腫瘤藥物篩選
3D列印病人原代HCC模型最具吸引力的應用就是腫瘤藥物的個性化篩選。為驗證這一功能，研究者在這6名患者的模型中測試了4種常用的經驗性靶向藥物（索拉非尼、侖伐替尼、瑞戈非尼、阿帕替尼）。
通過測定細胞存活率，研究發現，不同患者模型對於4種靶向藥物的反應又不甚相同。例如，2號與5號患者模型對於4種藥物均產生抗藥性；對於1號患者，索拉非尼展示出更好的抗腫瘤作用，而對於3號患者，則是侖伐替尼抗腫瘤效果更好。進一步通過基因突變譜與藥物靶標的對比測試，研究發現，藥物敏感性與突變靶標具有良好的一致性。
同時，全外顯子測序（WES）顯示了6例患者的相應突變譜。總體而言，藥物敏感性和突變靶標之間的良好一致性清晰可見。攜帶PDGFR和VEGFR家族突變的患者＃1，＃3，＃4和＃6對索拉非尼或lenvatinib或兩者均敏感。但是，在患者＃2和＃5中沒有藥物敏感性和突變之間的這種相關性。發現這兩名患者具有與其他患者相似的突變模式，但藥物敏感性差異很大，並且對所有四種藥物均具有耐藥性。造成這種差異的原因仍不清楚，但是對5號患者的轉錄組分析表明Raf-1，VEGFR1和VEGFR2的表達實際上被下調，這可能是實現此耐藥機制的重要線索。
使用患者衍生的3DP-HCC模型評估六種HCC患者的多種經驗靶向藥物的療效
為了實現針對患者的癌症特異性治療，研究者們不斷進行認真的努力，以建立可以代表人類腫瘤的各種體外模型。當前，可以通過不同方法建立四種類型的患者源性HCC模型，包括傳統的2D培養系統，類器官的3D培養系統，3D微流體培養和患者源性異種移植動物模型。其中生物3D列印的腫瘤模型優勢顯著。
現有肝癌模型對比
總結
本文首次使用患者原代肝細胞癌細胞構建多個3D列印個體化HCC模型，在長期培養過程中生長良好。這些模型保留了肝癌的親本特徵，包括生物標誌物，遺傳改變和表達譜的穩定表達和維持。3D列印HCC模型在長期培養中十分可靠，並可以直觀定量地針對患者進行個體化藥物篩選，在未來藥物檢測方面的巨大商業化應用價值。
關於作者
本文第一作者是來自北京協和醫院肝臟外科解飛虎博士，目前在中山大學腫瘤醫院肝膽外科工作。通訊作者是中國醫學科學院 北京協和醫院肝臟外科的毛一雷教授、楊華瑜副研究員、和中國醫學科學院 醫學生物工程研究所的黃鵬羽教授。
參考文獻
Feihu Xie, Lejia Sun, Yuan Pang, Gang Xu, Bao Jin, Haifeng Xu, Xin Lu, Yiyao Xu, Shunda Du, Yanan Wang, Shi Feng, Xinting Sang, Shouxian Zhong, Xin Wang, Wei Sun, Haitao Zhao, Hongbing Zhang, Huayu Yang, Pengyu Huang, Yilei Mao. Three-dimensional bio-printing of primary human hepatocellular carcinoma for personalized medicine. Biomaterials 2020 Sep 22;265:120416.doi: 10.1016/j.biomaterials.2020.120416.