題目：The circRNA circSEPT9 mediated by E2F1 and EIF4A3 facilitates the carcinogenesis and development of triple-negative breast cancer
期刊名稱：Mol. Cancer影響因子：15.302主要技術：RNA pull down、雙螢光素酶、RIP、ChIP研究背景越來越多的研究表明，circRNA與許多癌症的發生發展密切相關。然而，環狀RNA在三體陰性乳腺癌(TNBC)中的生物學功能和潛在的分子機制仍不清楚。作者運用高通量RNA測序技術研究了circRNA在四對三陰性乳腺癌及癌旁組織中的表達模式，並通過qPCR和原位雜交技術評估circSEPT9的表達和預後意義，並進行了一系列的體內和體外功能檢測實驗，以研究circSEPT9在三陰性乳腺癌變及發展過程中的調控作用。同時採用Chip、雙螢光素酶報告基因及RIP等檢測方法探討了E2F1和EIF4A3對circSEPT9的潛在調控作用，驗證了circSEPT9和mir-637的互作關係。技術路線
研究內容及結果1. circRNA測序及生物信息學分析篩選circSEPT94對三陰性乳腺癌及癌旁組織，通過circRNA二代測序，根據生物信息學分析發現354個差異表達circRNAs，其中上調circRNA 47個，下調circRNA 354個（篩選條件：fold_change≥2，P-value值＜0.05）。作者從TOP30個差異表達circRNA中又進一步篩選到一個novel circRNA，circSEPT9（hsa_circ_0005320，由SEPT9第二號外顯子反向剪切形成）作為項目研究重點（Fig. 1a）。針對circSEPT，作者從以下幾個方面層層進行驗證：(1). qPCR檢測驗證其在三陰性乳腺癌中表達上調(2). sanger 測序法驗證circSEPT環化位點（Fig.1b）(3). 分別設計divergent引物及convergent引物，以cDNA及gDNA為模板分別進行擴增檢測，驗證其確實為環狀RNA（Fig.1c）(4). 通過擴增及電泳檢測發現circSEPT9相比於線性SRPT9對RNase R消化的抵抗能力更高（Fig. 1d&e）(5). 使用放線jun素D抑制劑評估circSEPT9的穩定性（Fig. 1f）(6). FISH實驗對circSEPT9進行定位，主要分布於細胞質中（Fig1g&h）
圖1 三陰性乳腺癌細胞中circSEPT9的驗證及檢測
A. 4對三陰性乳腺癌及癌旁樣品top 15差異circRNA聚類熱圖，紅色代表上調，藍色代表下調B. sanger測序驗證環化位點及qPCR檢測表達量C. 以cDNA及gDNA進行擴增及凝膠電泳檢測D&E. 以RNase R處理三陰性乳腺癌細胞並通過PCR擴增檢測其表達量情況F. 放線jun素D處理12及24h後，通過qPCR檢測三陰性乳腺癌細胞中circSEPT9和線性SEPT9的表達G. 核質分離檢測circSEPT9表達，以GAPDH作為質對照，U6作為核對照H. FISH檢測實驗觀察circSEPT9定位，分別以組織及細胞進行染色拍照，細胞核採用DAPI染色2. E2F1和EIF4A3促進circSEPT9的表達E2F1是E2F轉錄因子家族成員，可在轉錄水平調控靶基因的表達。作者通過生物信息學網站預測（http://jaspar.genereg.net）發現SEPT9啟動子上有13個與E2F1結合的位點，作者從中選擇了3個最接近的結合位點，通過雙螢光素酶素酶及chip-qPCR進行驗證。為探索E2F1和EIF4A3對circSEPT9表達的影響，分別構建過表達質粒，同時合成幹擾siRNA，轉染三陰性乳腺癌細胞進行過表達及幹擾效果檢測，後進行qPCR檢測circSEPT9表達變化。實驗結果如下：(1). 篩選驗證有效的過表達質粒及幹擾siRNA分別轉染三陰性乳腺癌細胞MDA-MB-231及BT-549細胞後，qPCR檢測SEPT9表達，結果顯示：E2F1促進SEPT9的表達（Fig. 2a）(2). 通過構建野生型及突變型載體，通過雙螢光素酶實驗檢測生信預測SEPT9啟動子結合位點，結果顯示：所篩選2號及3號預測結合位置與E2F1結合，1號不結合（Fig. 2b&c）(3). 利用E2F1對應Chip級別抗體進行染色質免疫共沉澱實驗，實驗獲取互作DNA產物進行Chip-qPCR實驗分析結果表明：E2F1可以結合SEPT9基因啟動子區並加速其轉錄活性（Fig2d）小結：以上部分數據證明SEPT9是轉錄因子E2F1的靶基因。 EIF4A3是外顯子連接複合體的核心組成部分，在mRNA前期剪接中起著至關重要的作用。作者接下來又從circSEPT9的上遊和下遊區域找到5個與EIF4A3結合位點，並通過RIP實驗驗證其互作位點信息。同時在過表達及幹擾EIF4A3後qPCR檢測circSEPT9表達水平變化。作者進一步通過敲低circSEPT9後檢測三陰性乳腺癌細胞中細胞周期相關蛋白的表達變化，並通過挽救實驗共轉過表達質粒後再次檢測circSEPT9表達變化，實驗結果如下：(1). E2F1過表達及幹擾siRNA分別轉染MDA-MB-231及BT-549細胞後，qPCR檢測circSEPT9表達量變化，結果顯示：E2F1上調顯著促進了circSEPT9的表達，幹擾E2F1表達後抑制circSEPT9的表達（Fig.2e）(2). RIP分析結果顯示：EIF4A3可以通過推定的結合位點與SEPT9 pre-mRNA結合（Fig. 2g）(3). qPCR結果顯示：過表達EIF4A3促進circSEPT9的表達，幹擾EIF4A3後抑制circSEPT9表達（Fig. 2h）(4). 幹擾circSEPT9後，細胞周期相關蛋白表達下降（Fig.2i）小結：以上數據顯示EIF4A3通過促進circSEPT9的表達進而調節細胞周期相關蛋白的表達。
圖2 E2F1和EIF4A3分別與SEPT9啟動子和pre-mRNA結合增強circSEPT9的表達
（A） qPCR檢測過表達及幹擾E2F1後三陰性乳腺癌細胞中SEPT9表達變化。（B） 生物信息學預測並選定的SEPT9啟動子上E2F1 3個結合位點，其中包括野生型（WT）及突變型（Mut）序列。（C） 雙螢光素酶檢測SEPT9與E2F1對應3個結合位點。（D） 在MDA-MB-231細胞中進行Chip-qPCR檢測驗證結合位點（E） E2F1過表達及幹擾siRNA轉染三陰性乳腺癌細胞後qPCR檢測circSEPT9表達變化（F&G）RIP實驗證實EIF4A3可以與SEPT9 pre-mRNA結合（H）過表達及幹擾EIF4A3後，qPCR檢測circSEPT9表達（I）WB檢測細胞周期相關蛋白表達及灰度值統計（*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001）3. 細胞及臨床研究證實circSEPT9高表達臨床收集60對三陰性乳腺癌及癌旁組織樣品，同時在三陰性乳腺癌細胞MDA-MB-231、BT-549、MDA-MB-453、MDA-MB-468及正常乳腺上皮細胞MCF-10A中進行qPCR檢測circSEPT9表達，結果顯示circSEPT9在三陰性乳腺癌細胞及組織中的表達均高於正常乳腺上皮細胞及癌旁組織，與RNA-Seq結果保持一致（Fig. 3a&b）。作者進一步繪製ROS曲線用於評估circSEPT9對三陰性乳腺癌篩查的診斷價值，結果顯示：circSEPT9的曲線下面積（AUC）為0.711，在截距為1.971時，特異性和敏感性分別為75%和63.3%（Fig. 3c）。Kaplan-Meier生存分析結果顯示：乳腺癌患者中circSEPT9高表達（P=0.001）。N2-3階段（P=0.001）和TNM II/III期（P=0.031）總體生存率低於N0-1期和TNM I期（Fig. 3g），預示著circSEPT9可以作為腫瘤標記物，高表達circSEPT9造成患者的不良預後。
圖3 circSEPT9在三陰性乳腺癌患者中高表達並與患者不良預後有關
（A和B） qPCR檢測60對臨床三陰性乳腺癌及癌旁樣品及三陰性乳腺癌細胞及正常乳腺上皮細胞中circSEPT9表達（C）ROC曲線評估（D）原位雜交檢測circSEPT9在80個乳腺癌組織中的表達（比例尺，50um）（E）在80個TNBC組織中計算ISH染色分數，ISH染色得分＜6被定義為低表達，≥6視為高表達（F）在80例不同的三陰性乳腺癌患者中顯示circSEPT9 IHC評分的點分布圖（G） Kaplan-Meier生存曲線分析圖4. circSEPT9促進三陰性乳腺癌細胞的增殖、遷移和侵襲為探索circSEPT9潛在生物學功能，作者構建了circSEPT9過表達載體及幹擾siRNA（Fig. 4a），分別轉染細胞後qPCR檢測確定其過表達及幹擾效果（Fig. 4b&c），同時用線性SEPT9引物進行檢測發現過表達及敲低circSEPT9後對線性SEPT9基因的表達水平沒有顯著變化（Fig. 4d）。經克隆形成，CCK8及EDU分析其細胞生物表現變化，結果顯示：(1). 幹擾circSEPT9顯著抑制了三陰性乳腺癌細胞的增殖能力（Fig. 4e-g）(2). 過表達circSEPT9能有效增強細胞活力(3). 幹擾circSEPT9抑制了細胞的遷移和侵襲能力。過表達後相反（Fig. 4h-j）小結：circSEPT9在三陰性乳腺癌細胞中發揮致癌作用
圖4 幹擾cricSEPT9降低三陰性乳腺癌細胞的生長、遷移和侵襲能力
（A）circSEPT9過表達載體及si-circSEPT9示意圖（B-D）qPCR檢測三陰性乳腺癌細胞中circSEPT9過表達及幹擾效率（E） 克隆形成檢測細胞增殖能力（F） EDU檢測細胞增殖能力（G） CCK8檢測細胞生長曲線（H） Transwell檢測細胞侵襲能力（×100，100um）（I&J） 劃痕實驗檢測細胞遷移能力 （*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001）5. circSEPT9下調誘導細胞周期停滯、引發細胞的凋亡和自噬作者在幹擾circSEPT9的基礎上，進一步進行了三陰性乳腺癌細胞細胞周期，凋亡和自噬等方面的檢測。結果如下：(1). 細胞周期檢測結果顯示：幹擾circSEPT9後，細胞多分布於G1期，少數分布於S期（Fig. 5a）(2). Western-Blot實驗結果顯示幹擾circSEPT9後，細胞周期相關蛋白表達下降（Fig. 5b）(3). 流式細胞術檢測凋亡實驗結果顯示：下調circSEPT9後，細胞凋亡率顯著升高（Fig. 5c）(4). TUNEL分析結果進一步證實了流式的結果（Fig. 5d）(5). Hoechst33342染色實驗結果發現幹擾circSEPT9後乳腺癌細胞出現典型核收縮，核破裂等凋亡等特徵（Fig. 5e）(6). WB檢測凋亡相關蛋白結果顯示：下調circSEPT9後，凋亡相關蛋白caspase-3和凋亡蛋白Bax的表達量增加，Bcl-2的表達水平降低(7). 通過IF免疫螢光檢測顯示自噬相關指標LC3-II在幹擾circSEPT9組中增加（Fig. 5g），自噬相關蛋白ATG5和ATG7顯著增加（Fig. 5h）小結：circSEPT9參與調節細胞周期，凋亡及自噬等相關過程
圖5 幹擾circSEPT9誘導三陰性乳腺癌細胞周期停滯，細胞凋亡和自噬
（A）幹擾circSEPT9後流式檢測細胞周期（B）幹擾circSEPT9後，WB檢測三陰性乳腺癌細胞中細胞周期相關蛋白表達（C）幹擾circSEPT9後，流式細胞細胞術檢測細胞凋亡（D）幹擾circSEPT9後，TUNEL染色觀察細胞凋亡（E）幹擾circSEPT9後，Hoechst33342染色觀察細胞凋亡形態學特徵（F）幹擾circSEPT9後，WB檢測凋亡相關蛋白表達水平（G） IF免疫螢光檢測LC3-3B螢光強度（H） WB檢測自噬相關蛋白表達水平（*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001）6. circSEPT9與mir-637直接互作並抑制其活性為探究circSEPT9潛在分子機制，作者通過生物信息學分析預測其可能結合miRNA數據信息，最終確認mir-637作為其互作靶位點。通過qPCR檢測過表達及幹擾circSEPT9後對應mir-637的表達，並採用雙螢光素酶進行互作驗證，FISH檢測其定位情況，並經circRNA pull dwon進一步驗證，結果匯總如下：(1). 過表達circSEPT9後，mir-637表達量下降，幹擾組則相反（Fig. 6a）(2). 60例臨床樣品檢測mir-637表達，結果顯示其在正常組織中高表達（Fig. 6b）(3). 雙螢光素酶實驗結果顯示，添加mir-637 mimics後circSEPT9野生型組中螢光素酶報告基因的活性降低，突變組無變化，說明circSEPT9與mir-637直接結合（Fig.6e）(4). 通過FISH共定位檢測發現二者均定位在細胞質中(5). 進一步通過構建生物素標記的circSEPT9探針進行circRNA Pull down實驗拉取互作RNA，並通過qPCR檢測miR-637表達變化，進一步證實二者互作結合（Fig. 6h）小結：circSEPT9與mir-637互作
圖6 circSEPT9充當mir-637海綿
（A）過表達及幹擾circSEPT9後，qPCR檢測mir-637（B） 60例臨床三陰性乳腺癌及對照樣品中檢測mir-637（C） 皮爾遜相關分析（D） 雙螢光素酶預測結合位點示意圖（E） 雙螢光素酶檢測實驗（F） circSEPT9及mir-637共定位檢測（G） circRNA pull down檢測實驗 7. mir-637與circSEPT9共轉染功能研究為進一步研究circSEPT9與mir-637互作功能的相關作用，作者在三陰性乳腺癌細胞中進行共轉染實驗，結果顯示：(1). mir-637過表達基礎上進行circSEPT9過表達後顯著減弱了細胞增殖、遷移及細胞侵襲能力(2). 在幹擾circSEPT9的基礎上進一步幹擾mir-637後能逆轉circSEPT9造成的表型變化
Fig. 7 mir-637可以部分逆轉circSEPT9對三陰性乳腺癌細胞的增殖及遷移作用
（A&B） EDU檢測細胞增殖（C-E）三陰性乳腺癌細胞中的侵襲和遷移檢測8. LIF確認為mir-637靶基因激活LIF-STAT3通路發揮作用為進一步確認確認調控路徑，作者通過Targetscan（http://www.targetscan.org），miRanda（http：// www.microrna.org）以及Findtar在線程序（http://bio.sz.tsinghua.edu.cn），最終確認LIF作為mir-637下遊保守靶位點。作者通過一系列實驗對篩選下遊靶基因LIF進行檢測，結果如下：(1). qPCR及wb檢測結果顯示：在過表達mir-637後，LIF表達量下降，幹擾後則相反（Fig. 8a&b）(2). 雙螢光素酶檢測實驗對mir-637及LIF結合情況進行驗證，結果顯示：mir-637 mimics轉染組可以顯著降低LIF野生型組中的螢光值，突變組中無明顯變化（Fig. 8c&d）(3). 免疫組化IHC及IF免疫螢光檢測顯示：LIF在三陰性乳腺癌組織上調（Fig. 8e&f）(4). 皮爾遜相關分析表達LIF的表達與mir-637負相關（Fig.8h）(5). 相關分析表明LIF的表達與circSEPT9呈正相關（Fig. 8i）(6). qPCR及IF分析表明過表達circSEPT9後，LIF表達量顯著增加，幹擾後則下降（Fig. 8k&l）(7). 進一步結果顯示：過表達circSEPT9上調LIF，p-STAT3、ID1及MDM2，使P53及P21表達下降，幹擾後發揮相反的作用。小結：circSEPT9可以作為mir-637的海綿激活LIF-STAT3途徑促進三陰性乳腺癌變過程
Fig. 8 circSEPT9可以作為mir-637的海綿激活LIF-STAT3途徑促進三陰性乳腺癌變過程
（A&B）qPCR及WB檢測mir-637過表達及幹擾後LIF變化（C&D）雙螢光素酶檢測驗證mir-637與LIF互作結合（E&F） IHC及IF評估LIF的相對表達（G）臨床60例三陰性乳腺癌及癌旁樣本中qPCR檢測LIF（H&I） 臨床樣品中mir-637，circSEPT9與LIF相關分析（J）qPCR檢測過表達及幹擾circSEPT9後LIF表達（K）共轉染後LIF表達檢測（L） IF檢測共轉染後細胞中LIF表達（M）LIF及下遊LIF-STAT3途徑相關蛋白表達檢測小結作者從circRNA測序表達譜中專注於circSEPT9的機制研究，分別從生物學功能及機制方面對其在三陰性乳腺癌發生發展過程中的調控機制進行研究，最終確認circSEPT9可以作為新的診斷和預後或治療標記物。