前言
首先搞科研必須要有科研的心態。細心是幹任何事所必須具有的，對於科研更是至關重要，細節決定了成敗；信心也是要具有的，實驗失敗是再平常不過的事了，失敗一定不要氣餒，從頭分析，設計對照，逐一排除各項因素，找出問題的所在，不斷地改進，相信自己最終會成功的。恆心也是對於科研至關重要的，一項課題不是一天兩天完成的，需要日復一日的去做，有時候就是一個實驗操作要重複的做，因此只有擁有了恆心才能持之以恆的向最後的成功邁進。最後就是絕心，絕心就是指在進行任何實驗操作時要持有絕對的的態度，不可有模稜兩可，差不多的態度。這些是搞科研所必須具有的素質。用一句經典的話就是：複雜的事情簡單做，簡單的事情認真做，認真做的事情重複做，重複做的事情創造性做！
其次要掌握一定的方法。實驗之前必須進行分析，制定實驗計劃，分析影響因素。任何實驗基本上會經歷以下過程：
一、查閱文獻。查閱文獻時先查閱中文相關文獻，然後對相關內容有所了解後查閱外文文查閱外文文獻可以使用圖書館資料庫、NCBI中pumbed資料庫、谷歌學術搜索等。
二、 設計流程及時間表。對整個實驗流程事先必須要熟悉，以便根據自己的時間進行相關的時間安排，做到不急不躁，穩中求進。尤其不要忽視試劑用具準備及樣品處理的時間。
三、試劑及用具的準備及樣品的處理。材料用具準備的前提是對實驗的步驟充分了解，了解以後據直準備。對於分子生物學相關的實驗基本都需要無菌的試劑及用具，因此需要事先進行相關的滅菌處理。對於絕大多數試驗的第一步都需要樣品的相關處理，然後才能進行之後的相關實驗操作。樣品處理尤其是對某條件的多梯度處理時，一定要保證其他條件的一致性，方可具有比較性，因此處理樣品時要充分考慮如何控制其他條件的一致性。準備工作是整個實驗的核心，不可忽視，確保第一步必須要走好！
四、實驗設計及可能影響的因素。不同的樣品、不同的條件、不同的地方因此也決定了實驗的不同性。運用哲學說就是具體問題具體分析，共性中有個性。因此對於某個實驗操作不可完全照搬他人的實驗步驟，應根據自己的實驗進行相關的優化。另外每一步實驗操作的的原理必須要搞懂，這是優化實驗步驟和尋找問題所在的前提。
最後不要犯一些小的錯誤，要養成一些科研習慣。比如標記的習慣，無論個數少還是多都要按照標記的規則進行標記，尤其配製試劑時；做筆記的習慣，無論是達到了預期的結果還是失敗的結果都應做好筆記，這是以後反思的重要材料來源；還有就是正常工作的習慣，一時結果不好，不要挑燈夜做，這樣更不會有什麼效果，錯誤不斷，只有休息好了才能做好實驗。
本文主要詳細介紹了一些常規實驗操作步驟及注意事項以及部分生物信息學知識等內容，其內容都是編者所在實驗室常用的步驟以及編者在實驗過程中所遇問題的總結，特別適合於初學者的學習。本書參考了相關的文獻及程嬌嬌、曹京、王桂欒、毛瑞峰等的畢業論文以及網絡論壇、fermentas公司操作注意事項（http://www.fermentas.com/en/support/application）等內容，在此對他們表示感謝。特別對10級生物科學薛瀚師妹DNA重組章節及螢光定量部分的修正和總結也表示感謝。另外編者推薦幾個實驗技術交流的論壇：生物秀論壇，生命經緯，丁香園，生物谷等，供讀者學習交流使用。
由於小編水平有限，書中錯誤在所難免，還望以後的師弟師妹們繼續補充和修改。
最後送各實驗室的同志們，科研之路並不是一帆風順的，但我們一定要堅信：struggle and persist！
第一章 DNA提取
一、CTAB法
實驗原理
CTAB是一種非離子去汙劑可與DNA形成複合物，此複合物在高濃度氯化鈉溶液（20.7mM）下可溶，並穩定存在，但在低濃度下（0.1—0.5mM）沉澱，而大部分蛋白質、多糖仍溶於溶液中，經離心棄上清後，CTAB核酸複合物，用75%乙醇浸泡脫掉CTAB。
實驗步驟：
註：夏天取新鮮葉片時應帶冰盒，將取下葉片立刻放冰上，防止過度失水，另外取材儘量取用嫩組織。
1）取約1cm2的新鮮的幼嫩葉片於研缽，向研缽中加入600µl預熱的 2%的CTAB分離緩衝液和12ul的β—巰基乙醇（2%），研磨成漿，倒入1.5ml的離心管中。
1.此步主要是充分破壞細胞壁，使CTAB充分接觸細胞膜。
2.此方法為小量法，樣品的量要必須符合要求。
3.裂解時間儘量要短。
4.CTAB溶液在低於15℃ 時會形成沉澱析出，因此，在將其加入冰冷的植物材料之前必須預熱，且離心時溫度不要低於15℃。
5.轉移時可用剪去尖端的槍頭吸取。
（2）將離心管置於65℃水浴30min，其間每隔10min輕輕搖晃離心管，使其充分混勻
使CTAB充分破壞細胞膜，與DNA結合形成複合物溶於高鹽溶液。
(3）加入等體積的酚/氯仿/異戊醇（25:24:1），顛倒搖晃5min。
(4）12000r/min離心10min，收集上清
降至室溫後，再加酚/氯仿/異戊醇。4℃離心更容易去蛋白，故凡是抽提蛋白的，都可運用此條件。此後不再贅述。另外收集上清時應調小槍頭（50ul即可），緩慢吸取。此後不再贅述。
(5)加等體積酚/氯仿（1:1），混勻，12000r·min-1離心10min，取上清。
(6)加等體積氯仿/異戊醇（24：1），混勻，12000r·min-1離心10min，取上清
此步氯仿是為了除去上步殘餘的酚。
(7）向上清中加入兩倍體積預先冰凍的無水乙醇或一倍體積的異丙醇，置於-20℃冰凍30min。
降低CTAB的濃度，使DNA析出到難溶的乙醇中。加入醇類使其終濃度為70%左右沉澱效果最好。若雜質含量較多，可採用室溫沉澱。異丙醇沉澱較完全，但難洗滌，適合小量提取DNA沉澱。另外沉澱時間不是很嚴格，DNA可以在其中長期保存，但若想減少雜質含量儘量不要過長。
(8）12000r/min離心10min，棄上清，加入75%的乙醇，懸浮沉澱，常溫下靜置5min，棄上清。
離心之前將液體吸出，可以減少雜質的含量。但吸的時候一定注視槍頭尖部，不要把DNA吸走了。另外離心獲得的沉澱呈現透明狀，似果凍，若有粉末狀物質則可能蛋白質未抽提乾淨。
(9）室溫乾燥，溶於20µl 無菌水中，然後加入1/10體積的RNAase（1mg/ml）37℃處理40min後-20℃保存備用
晾乾之前，可短暫離心，將管壁乙醇聚集底部，後用移液槍吸去，能夠最大限度的減少乙醇的存在，加速晾乾。晾乾的標準是無酒精味即可，不可晾的時間過長。
二、SDS法
實驗原理
植物組織經液氮研磨破碎後，加入細胞提取液能進一步破壞細胞，釋放核酸。其中細胞提取液中的SDS可以破壞細胞膜，使蛋白質變性，EDTA可以抑制DNA酶的活性，防止DNA被降解。之後經過酚氯仿的多次抽提經離心後可以將細胞中的蛋白質、糖類清除，然後經乙醇沉澱獲得DNA。
(1)取0.5g菸草葉片，洗淨，吸乾表面水分，在液氮中迅速研磨成粉末狀（越細越好）
(2)轉移至1.5mL離心管中，加入600ml預熱的細胞提取液，充分混勻，65℃水浴保溫20min。
(3)加等體積酚/氯仿/異戊醇（25：24：1），混勻，12000r·min-1離心10min，取上清。
(4)加等體積酚/氯仿/異戊醇（25:24：1），混勻，12000r·min-1離心10min，取上清
(5)加等體積氯仿/異戊醇（24：1），混勻，12000r·min-1離心10min，取上清
(6)加等體積異丙醇或兩倍體積的無水乙醇，混勻，－20℃放置30min以上。
（7）12000r·min-1離心10min。
(8)去上清，加70%乙醇使沉澱懸浮並洗滌2次，每次12000r·min-1離心5min
(9)去上清，再短暫離心，用移液槍將殘餘的乙醇吸出，沉澱於室溫下晾乾，加20ul無菌水溶解。然後再加入1/10體積的RNAase（1mg/ml）37℃處理40min後-20℃保存備用。
參考文獻
魏群.分子生物學實驗指導[M].北京:高等教育出版社,1999,69-70
第二章RNA提取
本文詳細介紹RNA提取的實驗前準備及詳細實驗步驟，對於做克隆和螢光定量的同學們有所幫助！同時要時刻警惕RNA提取也做到無菌操作的水平！
Trizol法
實驗原理
Trizol內含異硫氰酸胍能迅速破碎細胞，同時使核蛋白複合體中的蛋白變性並釋放出核酸；由於釋放出的DNA和RNA在特定pH值下的溶解度不同，且分別位於中間相和水相，從而使DNA和RNA得到分離；取出水相後，通過有機溶劑(氯仿)抽提及異丙醇沉澱，可得到純淨RNA。
預備實驗
1.DEPC簡介
DEPC是一種潛在的致癌物質，主要是能生成乙酯基衍生物和乙酯類衍生物，其中尿烷是一種已知的致癌物質。DEPC有刺激性，對眼睛和氣道黏膜有強刺激，在操作中應儘量在通風的條件下進行，DEPC毒性並不是很強，但吸入的毒性是最強的，使用時戴口罩，不小心佔到手上注意立即衝洗。由於DEPC是一種酯類，較難溶於水，故通過加熱攪拌的方式來使其溶解。
2.1%的DEPC水的製備（1L）
取1mlDEPC於999ml去離子水中，37℃在磁力攪拌器上攪拌4h以上使其溶解。此溶液即1%DEPC水。
注意：
①DEPC與水反應後會產生大量的氣體，可用塑料膜將瓶口紮緊，劇烈混勻後通過觀察塑料膜是否脹氣來判斷反應是否充分
②DEPC水的量可以根據需要配製即可，原則上確保所有的物品都能浸在DEPC水中。
③製備的1%DEPC水，應留下100ml左右並裝入100ml左右的試劑瓶中，以備溶解RNA用。注意：根據試劑瓶的大小調節所留的DEPC水的量，原則是確保DEPC水能夠充滿整個試劑瓶，並且盛有DEPC水的試劑瓶也要放置過夜，然後高溫高壓滅菌使DEPC分解後才能用於溶解RNA。
④配製DEPC處理水時用棕色瓶。
3.離心管、各種大小的槍頭（1000ul、200/100ul、10ul）根據步驟及提取的量計算所需的個數，然後用制好的1%DEPC浸泡比計算數目略多的過夜處理。
注意①處理方法：用鑷子夾住離心管，然後浸入DEPC水中，使離心管中充滿液體，然後再倒出，反覆2次，最後一次再浸入DEPC水後直接浸入其中，無需倒出。而槍頭則用最大量程的槍吸打DEPC水2次，最後一次吸入後不再打出，直接把槍頭推至DEPC水中。
②處理完畢後，離心管一般用一培養瓶盛裝，槍頭用槍頭盒盛裝，故DEPC處理時也應包含這些器皿。
4.研缽、研棒、試劑瓶、鑷子、廢液瓶等用錫箔紙包好口後200℃乾熱滅菌4h。
5.RNA酶的來源。大量的微生物存在於空氣中、水中及物體的表面，當它們死亡時，會釋放大量的RNAase。對於人的皮膚、粘液、唾液等都因為直接或間接的與空氣接觸而攜帶有RNAase。
實驗步驟
主要參見trizol試劑的說明書，以下步驟僅供參考。
(1)取離心管做好標記，0.2g樣品液氮研磨成粉末狀，加1mlTrizol，漩渦混勻，室溫靜置5min。
可提前將離心管放液氮涼一會；一定要將材料研磨充分，且一旦研磨完畢立刻加入Trizol混勻。這一步是能否提出RNA的關鍵。
(2)加200µl氯仿，上下顛倒15s，室溫靜置3min。
提前打開冷凍離心機，若在夏季進行實驗需開啟製冷開關。
(3)12000 r/min 4℃離心15min。
(4)取離心管，樣品分三層(無色上清水相，中間白色層，粉色下層有機層)小心吸取無色上清至另一新離心管。收集上清時應調小槍頭（50ul即可），緩慢吸取。
(5)加入等體積異丙醇，輕輕混勻，冰浴10-20min。
這段時間可以用滅菌處理的DEPC水配製75%乙醇。
(6)棄上清，用75%乙醇1ml懸浮沉澱。
(7)12000 r/min 4℃離心10min。
離心之前一定要懸浮沉澱，即指用移液槍將沉澱打起。
(8)棄上清，再短暫離心，用移液槍將殘餘的乙醇吸出，沉澱於室溫下晾乾。
晾乾的標準是無酒精味即可。
(9)加入30-50µlDEPC處理的水溶解RNA。
提取完畢後分出2管，其中一管裝2ulRNA，用於濃度的測定；另一管裝2—5ul，用於電泳檢測。濃度測完後根據反轉錄的要求分裝小管，保證每一管符合反轉錄反應所需的RNA的質量。若用於半定量，則必須保證各樣品每管的質量均相同。
（10）電泳時用3%H2O2對電泳整個裝置消毒。
（11）取1—2ul進行電泳檢測及濃度檢測。
（12）分裝，-80℃保存。
注意事項
1. 氯仿、異丙醇、乙醇都應用未開封的，75%的乙醇用移液槍配製，勿用量筒等中間器皿。
2. 整個過程要及時更換手套，戴雙層口罩，並在操作區開啟酒精燈。
3. RNA一定要貯存到-70℃冰箱，在-20℃保存時間很短。
4. 配製的溶液應用滅菌處理的DEPC水。
5. 移液器： RNase的又一汙染源是移液器。根據移液器製造商的要求對移液器進行處理。一般情況下採用用DEPC配製的70%乙醇擦洗移液器的內部和外部，基本達到要求。
RNA提取，對於整個分子生物學實驗來說，算是比較有難度的操作了，提取出RNA如何判斷質量的好壞呢？那當然通過電泳圖了。本次小編將講述電泳圖上的秘密，幫助您更好的來提取RNA，提高成功概率。
結果分析
1. RNA條帶不亮或缺失
（1）上樣量不足。
（2）染色劑不足或染色劑分布不均勻。
（3）RNA跑出凝膠。電泳至溴酚藍至凝膠的2/3即可停止電泳。另外電泳槽應水平放置，緩衝液要浸過凝膠，
（4）RNA在凝膠中發生擴散。避免長時間的電泳，否則小片段容易擴散。
（5）RNA降解。最大限度減少在紫外線下暴露的時間，使用新鮮的電泳緩衝液，新制的凝膠，電泳槽及制膠的模具梳子等用雙氧水浸泡，高電壓短時間電泳（20min）。也可能使用的組織材料不夠新鮮（冷凍的材料必須在化凍之前將其磨碎）。
2. RNA條帶彌散
（1）RNA被核酸酶降解。要用新的緩衝液，制膠用的模具要清潔，槍頭要滅菌。
（2）電泳條件不適合。避免長時間電泳，緩衝液要浸過凝膠，電壓要合適，不能過低。電壓過高，造成電流過大，也容易引起此現象的發生。一般5—8V/cm.（聚丙烯醯胺電泳多採用8V/cm）所以計算採用電壓時應先測量電泳槽兩電極之間的距離。為了增加條帶的清晰度，電泳開始的幾分鐘建議使用低電壓。
（3）上樣量過大。根據沉澱量的多少確定點樣的量，一般1—3ul。
（4）膠孔不規則。插梳子時應垂直插入，凝固後拔出梳子。
3. 背景很高
（1）核酸染劑加入的量過多。應按說明書添加。
4. 點樣孔發亮
（1）上樣量過大。
（2）膠孔未凝固好，使樣品無法往前移動。
（3）RNA樣品中含有汙染物，如殘留的蛋白質容易引起此現象。可能trizol量太少，應加大trizol用量。另外若殘留DNA也應考慮加大trizol用量。
5. 出現多條帶
（1）RNA降解。提取過程中出現降解或電泳過程中出現降解（可能性較小）。
（2）上樣量過大。RNA由多種類型組成，若上樣量過大則會導致各種類型的RNA（tRNA，mRNA等）均會出現條帶。
提取常見問題
1.研磨必須要充分，樣品用量要嚴格。
2.處理的槍頭離心管要量少多份，無RNAase的DEPC水也要量少多份，以備分裝RNA和調濃度使用。
3.電泳時間10-20min，不宜過長，電壓可為120-130V。
4.點樣用的10ul槍頭也要提前處理。
5.槍頭離心管90℃烘乾5——6h。
6.電泳時，可以點樣Marker作陽性對照。
7.從-70℃冰箱中取出材料要在解凍之前迅速研磨。
8.提出的RNA可在70%酒精-70℃保存一年。
9.所有的東西必須有多餘，防止出現用品的損失。
10.試劑瓶可以連續使用。
附：核酸提取注意事項
提取一種核酸時，首先應該查閱文獻，了解是否有前人嘗試此種物種核酸的提取方法，若有則可以參照其方法進行提取，否則應首先了解此種植物含糖類、酚類、次生代謝物等物質的多少，然後制定相應提取方案，以實現最大程度的去除這些物質。提取核酸材料選擇是至關重要的。新鮮幼嫩的組織往往糖類、酚類、次生代謝物等雜質含量少，因此提取的核酸質量（純度）會較高，對後續的PCR、酶切等反應有利，而老的組織由於各種雜質含量都較高，因而不易獲得純淨的核酸，影響後續的各種酶促反應。
關於破碎細胞。破碎細胞一般是採用研磨法。在研磨之前將材料剪成小塊，可以直接研磨也可以用液氮研磨（但提RNA必須用液氮研磨），將組織磨成勻漿即可。在這裡對冷凍的材料特別要求從冰箱中取出後要迅速稱量，然後研磨，在提RNA時要保證材料在液氮研磨之前不能融化。
關於稱取樣品質量。根據提取量的要求，選擇一次研磨的質量，然後平均分至各管中（後面的步驟均為提一管所需的各試劑的量）。
酚/氯仿/異戊醇在抽提過程中的作用。酚對蛋白質的變性作用遠大於氯仿，但是酚的比重略比水重，碰到高濃度的鹽溶液，離心後酚相會跑到上層，不利於含質粒的水相的回收；但加入氯仿後可以增加比重，使得酚/氯仿始終在下層，方便水相的回收；另外酚與水有很大的互溶性，如果單獨用酚抽提後仍有大量的酚溶解到水相中，其會抑制後續的酶促反應（比如限制性酶切反應），因此單獨用酚抽提後一定要用氯仿抽提一次將水相中的酚去除，而用酚/氯仿的混合液進行抽提，跑到水相中的酚則少得多，但最好再用氯仿抽提一次，將酚完全除去。異戊醇，其作用主要是為了讓離心後上下層的界面更加清晰，方便水相的回收。另外在一次酚/氯仿抽提之後，上清液仍然呈現較深的顏色，則可以考慮再次進行酚/氯仿抽提。因為在植物中存在各種色素，主要包括脂溶性色素與水溶性色素兩類。脂溶性色素多為四萜類衍生物，主要有葉綠素、葉黃素、胡蘿蔔素、番紅花素和辣椒紅素等，它們易溶於乙醇，酚和氯仿等溶劑。其中胡蘿蔔素不溶於乙醇。水溶性色素主要為花色甙類，又稱花青素，普遍存在於花中。可溶於水與乙醇，不溶於乙醚與氯仿等有機溶劑。因此一般可以通過再次酚/氯仿抽提將色素除去。
對於沉澱核酸方法的討論。沉澱核酸主要通過有機溶劑法沉澱，原理主要是降低了介電常數，破壞了了核酸分子表面的水化層。另外還可以利用等電點法和鹽析法沉澱，如利用醋酸鈉（3M，pH5.2），一方面高鹽濃度破壞核酸分子水化層另一方面使其接近核酸等電點。（核酸的等電點比較低。如DNA的等電點為4～4.5，RNA的等電點為2～2.5）。常用的有機溶劑是乙醇和異丙醇，它們的區別是：沉澱DNA 通常使用冰乙醇,在低溫條件下放置時間稍長即可使DNA沉澱完全。而沉澱RNA通常使用異丙醇。異丙醇沉澱速度快但通常把鹽分也沉澱下來。在使用量上，乙醇終濃度為70%即之前的溶液中加入2—2.5倍體積的無水乙醇，使其濃度達到70%左右，而異丙醇一般使用等體積的量。之後的70%乙醇起到洗滌和再次沉澱的作用。
關於沉澱結束後的操作。沉澱結束後，若沉澱量較大，可以考慮用槍頭或滅菌牙籤等將沉澱「鉤出」，放入新的離心管中，然後用70%乙醇洗滌；若沉澱量較少，沉澱結束後可以將無水乙醇最大量的吸出然後離心。這樣可以明顯減少提取核酸中鹽分、糖類等雜質的含量。
關於乙醇洗滌。常用70%濃度可以有效去除鹽離子另外可以洗滌兩次，效果會更好。洗滌完成後，必須要晾乾，才能進行溶解，防止殘留乙醇影響後續的酶促反應。
關於溶解核酸溶劑的選擇。當想長期保存，暫時不進行下一步實驗時，採用TE緩衝液，其中的Tris-HCl的提供一種緩衝系統，EDTA可以螯合二價金屬離子進而抑制依賴於二價金屬離子的DNA酶的活性，對DNA起到保護作用。
第三章 PCR
整天談論測序，那測序裡面關鍵的一環是什麼呢？當然是PCR了。呵呵，本次小編就寫給只會做分析而不會做實驗的的生物信息小夥伴們。很重要奧，所有的分析最終都要落到驗證上奧！
一、實驗原理
PCR是體外人工選擇性擴增DNA的一種方法，它類似於生物體內DNA的複製。在生物體內DNA複製需要模板、引物、DNA聚合酶、DNA解旋酶、 dNTPs；而體外PCR反應同樣需要類似的成分，有模板、引物、PCR Buffer、Taq酶、dNTPs。其中引物是人工設計的特定序列，實現對特定位置的擴增；PCR Buffer提供一個反應的緩衝環境；反應過程同生物體內一樣，DNA雙鏈打開，引物結合模板，延伸形成新鏈。而這些過程在生物體內靠DNA解旋酶解鏈，而在體外在通過控制反應溫度實現的。如常用94℃變性模板DNA打開雙鏈，在退火溫度處引物結合到模板上，最後在72℃完成延伸，並反覆重複此過程即可實現對特定片段DNA的大量擴增。到第三循環開始才產生出和靶DNA區段相同的DNA分子，進一步循環地產生出靶DNA區段的指數加倍。
在擴增後期,由於產物積累,使原來呈指數擴增的反應變成平坦的曲線,產物不再隨循環數而明顯上升,這稱為平臺效應。平臺期(Plateau)會使原先由於錯配而產生的低濃度非特異性產物繼續大量擴增，達到較高水平。因此，應適當調節循環次數，在平臺期前結束反應，減少非特異性產物。到達平臺期(Plateau)所需循環次數取決於樣品中模板的拷貝。
二、主要的成分
模板
1.模板可以是多種形式，主要包括基因組DNA、質粒DNA、攜帶病毒的基因組DNA、PCR產物，cDNA等，但不能為RNA。對於不同類型的模板，其主要不同在於預變性的時間以及模板的量。一般對於大的基因組DNA預變性時間10min足夠，質粒DNA2min、攜帶病毒的基因組DNA預變性2min、PCR產物預變性2min即可。
注意cDNA為單鏈DNA，但仍可做PCR的模板，只不過在第一輪循環時只有一個引物結合，合成另一條鏈。從第二輪開始，兩個引物均與特異位點結合，從而實現了與常規PCR的接軌。而同作為單鏈的RNA卻不能進行PCR擴增，原因就在於實現PCR反應的是DNA聚合酶，只能特意識別DNA鏈。
2.對於模版的量來說，一般25ul體系DNA的質量為50—100ng。對於基因組DNA由於其結構比較複雜，提取的濃度也往往比較大，為防止濃度過大對PCR造成影響，故需對提取的DNA進行梯度稀釋。否則濃度過高則可能會引起非特異性擴增。對於質粒及PCR產物由於其結構簡單，且提取濃度一般較低，則無需稀釋。
引物
１．一般引物用貯液濃度為10uM。對於剛合成的引物可以根據期管壁上的說明計算稀釋至10uM即可（一般引物說明上配製的濃度往往過高，所以必須稀釋至10uM才能利用實驗室最小刻度（0.5ul）的移液器取到）。另外引物一旦稀釋完畢，應注意分裝小份，防止在用的過程中反覆凍融引物而造成引物的失效。
2.一般25ul反應中引物用量為0.5ul（終濃度要求為為0.1——1uM），若引物若放置時間比較長，則可以適當增加引物的用量。引物用量過多，容易導致引物二聚體（電泳時位於前方不成條帶的小片段）的出現。
附：
1.引物稀釋的方法：配製時首先將合成的引物12000r/min離心5min，室溫靜置１分鐘，然後再慢慢打開管蓋，根據引物合成單（或儲存引物的離心管）說明加入一定量的滅菌水（引物說明是加入Buffer，此處加入無菌水即可）以達到10uM的濃度，在漩渦振蕩器上充分振蕩5-10min，即配成10um的貯存液，-20℃保存備用
PCRbuffer
一般PCR Buffer為10×的，使用時終濃度應為1×。如25ul體系中，應加入10×PCR Buffer為2.5ul。另外使用時應注意是否添加了Mg2+，若沒有，則需要再單獨添加，有則無需。
Mg2+
推薦用量為１—４ｍM。濃度過低，影響PCR產物的產量，而濃度過高，則出現非特性擴增。在PCR反應中Mg2+濃度，需進行優化。
三磷酸脫氧核苷酸（dNTPs）
避免反覆凍融，應分裝小份。dNTP的濃度取決於PCR反應體系中的特定靶序列的長度，常用濃度為0.2 mM。據此我們可以確定反應體系中的dNTP的最低適宜濃度。當dNTP的濃度大於50mmol/L時會抑制Taq酶的活性。需要注意的是dNTP與Mg2+之間的濃度關係。因為dNTP中的磷酸基團可與Mg2+結合，使反應體系中游離Mg2+濃度下降從而影響Taq 酶的活性。
Taq酶
PCR使用的Taq酶在反應時由於喪失3』——>5』外切核酸酶活性，因而不具有校正活性。在典型的一次PCR反應中，taq酶造成的錯誤的核苷酸錯誤的摻入率大概為每20000個核苷酸中就有一個，雖然表面上看起來不會有多大的影響，但是在分子克隆中如果有一個錯誤核苷酸摻入，很有可能造成移碼突變，影響是嚴重的。為彌補taq酶這一缺點常將克隆後的序列進行測序，來確認所擴增序列的準確性。同時也可採用保真度更高的Pfu DNAPolymerase，來確保擴增的準確性，Pfu DNAPolymerase有3 』-5』的外切酶活性，5』-3』外切酶活性，是目前已發現的所有耐高溫DNA 聚合酶中出錯率最低的。但PCR產物為平端，不能進行Ta克隆！而解決此問題的辦法是使用TaqPlus DNAPolymerase，該酶是Taq 酶和pfu Polymerase的混合物，因此既能保證準確性又能保證能夠進行Ta克隆。在使用中應該注意如下問題：
1．25ul體系中一般用量為0.1ul（用槍頭沾一下即可），用量過多可能會出現非特異性擴增。
2.PCR體系構建過程中最後加入的一種成分，因此只有在其他試劑加完之後才可從冰箱中取出加入。
3.Taq酶中含有甘油，故不結冰，若結冰則應丟棄。
4.對於預變性時間較長的PCR反應，應在預變性即將結束後加入酶，減少長時間高溫對酶活力造成的損傷。
5.保存時間過長的酶可以適當增加用量。
三、體系構建
1.加樣原則是酶最後加，倒數第二加的為模板。加樣時應從離心管底部將各成分依螺旋式上升的方式加到管壁上。如果做多管PCR，那麼按照如下方法計算出公共成分做n管時所需總體積然後混合均勻之後再分裝到各個離心管中去，這樣可以有效地避免誤差及汙染。
V總 =V標×（n+1）
其中V總需配製的總體積V標每管PCR反應需要某成分的標準體積，n表示所做PCR的管數。
2設立適當的陽性對照和陰性對照，檢測PCR各試劑的可用性及汙染性，便於對電泳結果準確的分析。
四、預實驗
準備一個冰盒，並將做PCR的各試劑（除酶）、模板及無菌水放到冰上融化，設置PCR儀上反應程序。
五、實驗步驟
下列步驟均在冰上操作
1. 取1.5ml離心管，加入各公共成分（除酶）的V總，然後分裝於各PCR管中，最後將酶加入。
2. 瞬時離心10s，將各成分混勻。
3. 放入PCR儀反應。
4. 4℃冰箱保存。
5. 電泳檢測。
註：常用於PCR的DNA聚合酶多要求反應必須冷啟動，即反應必須在瞬間從低溫達到變性溫度（一般94℃）。但有些酶需要熱啟動，則無需在冰上操作，但酶同樣還是需要現用現取，保持酶的最大活性。
示例 PCR反應體系（25µl）及條件如下：
質粒DNA 0.5µl
上遊特異性PCR引物 0.5µl
下遊特異性PCR引物 0.5µl
10×PCRbuffer 2.5µl
Mg2+ 1.5µl
dNTP 0.5µl
Taq PCR聚合酶 0.1µl
滅菌水 18.9µl
預變性 94℃ 2min
變性 94℃ 30s
退火 59℃ 30s
延伸 72℃ 1min
循環數 30 cycles
後延伸 72℃ 10min
附：PCR反應參數
１．預變性。預變性的目的就是破壞DNA的二級結構，使ＤＮＡ充分變性，以便於引物與模版的結合，尤其對於結構複雜的基因組DNA，這一步更是必不可少的。
２．循環階段。
①變性：一般９４℃，具體參照酶說明書。
②退火：引物與模版結合。其中退火溫度會由於引物的不同而有所不同的。退火溫度的計算可以有兩種方法。一是引物設計時引物設計軟體提供了一個參考的退火溫度可以參考使用。二是Tm 值也可以根據 Tm=4(G+C)+2(A+T)計算。兩種引物的Tｍ值往往在引物合成單上被註明，故可以直接查閱。在確定退火溫度時，往往是使用Tm低的引物的Tm減去5℃作為退火溫度的一個基點向上向下（±10°C）摸索退火溫度。為提高特異性，也可在最初的5個循環使用Tm高的引物作為Tm，後面的循環使用Tm低的。由於低的退火溫度可以使引物與模板很好的結合，高的退火溫度可以提高特異性，故在確定退火溫度時應設置梯度，並不斷優化，以確定最終的退火溫度。對於豐度極低的模板的PCR,特別是稀有RNA模板的反轉錄PCR(RT PCR)得到的cDNA模板,在最初的1～5個循環可以用更低的退火溫度,然後再行正常的退火溫度,這樣能明顯提高PCR的成功率。退火溫度高為什麼特異性好呢？因為退火溫度高非特異性結合會使引物與模板結合不牢固而容易解離下來，不能進行擴增，因而只有特異結合引物擴增模板，獲的目的條帶
③延伸：一般７２℃，對於擴增長片段（>=3kb）的PCR，一般採用68℃。延伸速度一般為1kb/min，具體的參見酶說明書。
④關於循環次數。一般採用25—35次，不可採用過多的循環次數，達到需要的量即可。具體要參照模板的量和希望得到的PCR產物的產量。
３．後延伸。循環結束之後最後的一步延伸主要起的作用是：
①使PCR反應完全，從而提高PCR產量。
②產物末端加A尾的作用，因而可以直接用於TA克隆。
第四章電泳
一、電泳技術原理（以瓊脂糖凝膠電泳為例）
1、首先介紹使用的載體--瓊脂糖。
瓊脂糖是線性的多聚物，基本結構是1,3連結的β-D-半乳呋喃糖和1,4連結的3,6-脫水α-L-半乳呋喃糖。瓊脂果膠是由許多更小的分子組成的異質混合物。瓊脂糖在水中一般加熱到90℃以上溶解，溫度下降到35-40℃時形成良好的半固體狀的凝膠，這是它具有多種用途的主要特徵和基礎。瓊脂糖凝膠性能通常用凝膠強度表示。強度越高，凝膠性能越好。質量較好的瓊脂糖強度通常在1200克/cm2以上（1%膠濃度）。
為啥用它呢，因為他有很多優點奧！
瓊脂糖的凝膠性是由存在的氫鍵所致，凡是能破壞氫鍵的因素都能導致凝膠性的破壞。瓊脂糖具有親水性，並幾乎完全不存在帶電基團，對敏感的生物大分子極少引起變性和吸附，是理想的惰性載體。天然瓊脂（agar）是一種多聚糖，主要由瓊脂糖（agarose，約佔80%）及瓊脂膠（agaropectin）組成。瓊脂糖是由半乳糖及其衍生物構成的中性物質，不帶電荷，而瓊脂膠是一種含硫酸根和羧基的強酸性多糖，由於這些基團帶有電荷，在電場作用下能產生較強的電滲現象，加之硫酸根可與某些蛋白質作用而影響電泳速度及分離效果。在瓊脂糖製備過程中需要把瓊脂果膠儘量去除，否則瓊脂糖有可能存在極微量硫酸根和丙酮酸取代電離基團，就會造成電內滲（EEO），電內滲對質點的移動產生影響，因而質量較好的瓊脂糖硫酸根含量比較低，通常在0.2%以下，電內滲比較小，通常在0.13以下。這也就是瓊脂糖比瓊脂貴那麼多的原因了。此外，瓊脂糖凝膠還有以下特點：
（1）瓊脂糖凝膠電泳操作簡單，電泳速度快，樣品不需事先處理就可以進行電泳。
（2）瓊脂糖凝膠結構均勻，含水量大（約佔98%~99%），近似自由電泳，樣品擴散較自由，電流對樣品吸附極微，因此電泳圖譜清晰，解析度高，重複性好。
（3）瓊脂糖透明無紫外吸收，電泳過程和結果可直接用紫外光燈檢測及定量測定。
（4）電泳後區帶易染色，樣品極易洗脫，便於定量測定。製成幹膜可長期保存。
總之瓊脂糖凝膠電泳常用於分離、鑑定核酸，如DNA鑑定，DNA限制性內切核酸酶圖譜製作等。由於這種方法操作方便，設備簡單，需樣品量少，分辨能力高，已成為基因工程研究中常用實驗方法之一。
2、瓊脂糖凝膠電泳原理
DNA分子在常規的電泳緩衝液（高於等電點的pH溶液）中5』磷酸的氫離子解離被中和，而只剩磷酸根離子，故帶負電，因而在電場中向正極移動（電荷效應）。又由於瓊脂糖凝膠具有分子篩效應，在一定的電場強度下，DNA分子的遷移速度取決於分子本身的大小和構型。因此瓊脂糖凝膠電泳不僅可分離不同分子量的DNA，也可以分離分子量相同、但構型不同的DNA分子，如質粒三種構型。
在構型相同條件下，具有不同分子量（鹼基對）的DNA片段遷移速度不一樣，DNA片段遷移距離與分子量（鹼基對）的對數成反比，所以可以通過已知大小的標準物移動的距離與未知線性DNA片段的移動距離進行比較，便可測出未知DNA片段的大小。同時由於電荷效應存在，因此在測定DNA分子大小時，可以提高凝膠的濃度和降低電壓，減少電荷效應，增強分子篩效應而提高測量準確性及電泳的解析度。
3、明白了上述原理那看圖吧！
（1）線性染色體DNA
其廣泛分布於動植物細胞中，為染色體的主要成分，多呈現雙螺形。其電泳結果多呈現一條帶，接近點樣孔。若未用RNAase處理，則最前方很亮的為RNA。
（2）質粒DNA
一般提取的質粒有3種構型：
1、超螺旋的共價閉合環狀DNA(covalently closed circular DNA，簡稱cccDNA)，
2、開環DNA，即共價閉合環狀質粒DNA有一條鏈斷裂，(open circular DNA，簡稱ocDNA)，
3、線狀質粒DNA，即質粒DNA 在同一處兩條鏈發生斷裂(linear DNA，簡稱LDNA)。
由於這3種構型的質粒DNA分子在凝膠電泳中的遷移率不同，其中超螺旋質粒DNA泳動最快，其次為線狀DNA，最慢的為開環質粒DNA。通常提取的質粒DNA呈現兩種構型，即電泳後呈現兩條或一條帶。
（3）總RNA
提取的總RNA一般呈現三條帶，由於rRNA在細胞中含量最高，且提取的rRNA的質量可以反映總RNA提取的質量，故可以根據rRNA(真核生物)的三種形式5S,18S,28S的質量進行判斷。如果28S的亮度在18S條帶的兩倍以上，我們認為RNA的質量是好。
註：
S為沉降係數（sedimentationcoefficient），當用超速離心測定一個粒子的沉澱速度時，此速度與粒子的大小直徑成比例。5S含有120個核苷酸，16S含有1540個核苷酸，而23S含有2900個核苷酸。而真核生物有4種rRNA，它們分子大小分別是5S、5.8S、18S和28S，分別具有大約120、160、1900和4700個核苷酸。rRNA是單鏈，它包含不等量的A與U、G與C，但是有廣泛的雙鏈區域。在雙鏈區，鹼基因氫鍵相連，表現為髮夾式螺旋。
二、設備與試劑。
1、電泳裝置主要包括兩個部分：電源和電泳槽。
電源提供直流電，在電泳槽中產生電場，驅動帶電分子的遷移。
電泳槽可以分為水平式和垂直式兩類。
垂直板式電泳是較為常見的一種，常用於聚丙烯醯胺凝膠電泳中蛋白質的分離。電泳槽中間是夾在一起的兩塊玻璃板，玻璃板兩邊由塑料條隔開，在玻璃平板中間製備電泳凝膠，凝膠的大小通常是12cm 14 cm，厚度為1mm～2? mm，近年來新研製的電泳槽，膠面更小、更薄，以節省試劑和縮短電泳時間。
2、試劑。 DNA要遊泳，則必須要有水，用的水那是什麼呢？比較常用就是這兩種了：TAE（Tris/Acetic/EDTA）和TBE(Tris/Borate/EDTA)
1）TAE
配製：一般配製50×的母液，使用時將其稀釋至1×。
特點：TAE是使用最廣泛的緩衝系統。其特點是超螺旋在其中電泳時更符合實際相對分子質量（TBE中電泳時測出的相對分子質量會大於實際分子質量），且雙鏈線狀DNA在其中的遷移率較其他緩衝液快約10%，電泳大於13kb的片段時用TAE緩衝液將取得更好的分離效果，此外，回收DNA片段時也易用TAE緩衝系統進行電泳。TAE的缺點是緩衝容量小，長時間電泳（如過夜）不可選用，除非有循環裝置使兩極的緩衝液得到交換。
應用：大片段核酸分子分離，瓊脂糖凝膠電泳DNA的回收，酶切檢測，PCR反應。
2）TBE
配製：常配製成5×的母液，使用時稀釋至0.5×使用（配製成5×的可以放置較長時間而不形成沉澱）。
特點：高濃度儲存液易發生沉澱，故母液的配製量一次不宜過多，一旦配出後應儘快用完。
應用：對於一般的僅做檢測的電泳常用此緩衝液，如DNA、質粒、RNA提取後的檢測。
3）TAE與TBE的區別
TAE是Tris-乙酸，緩衝容量小，但是溶解度大，易於儲存。採用TAE長時間電泳發熱大，遷移速度較快，利於長片段的電泳。
TBE是Tris-硼酸，緩衝容量大，但是溶解度小，不易長期儲存，易產生沉澱。其對小於1kb的片段分離效果較好，但因與瓊脂糖相互作用生成非共價結合的四羥基硼酸鹽複合物而使DNA片段的回收率降低，而且硼酸鹽 離子有可能影響後續的酶促反應，因此回收電泳一般不推薦TBE電泳。
4）上樣緩衝液（Loading Buffer）。
DNA分子在電泳中如何讓他停下來，不讓它從我們的凝膠中跑出去，這時就要實時監控了！除了實時監控，還必須讓他沉下去，才能泳動！哈哈，用啥呢？常用的有6×的和10×的loading buffer了，一般在購買的酶製劑中均帶有。下面小編就詳細介紹了！
作用：第一，上樣緩衝液具有指示劑溴酚藍和二甲苯酚，它們起到指示的作用，顯示電泳的進程，以便適時終止電泳；第二，裡邊的成分甘油可以加大樣品密度，使樣品密度大於TAE，從而沉降到點樣孔中，防止樣品飄出點樣孔。另外，10×Loading Buffer是加有SDS的。SDS主要是促使聚合酶變性，因為沒有除盡的聚合酶會結合在DNA雙鏈上影響它的遷移速率。
使用上：兩種緩衝液均可用於DNA和RNA電泳，但更有所側重。6×LoadingBuffer，向電泳樣品溶液中加入1/6量即可進行凝膠電泳，常用於DNA電泳。10×Loading Buffer是用於瓊脂糖凝膠電泳的10倍濃度的核酸樣品用，常用於RNA凝膠電泳。由於該製品中含有SDS， 容易起沫，故點樣時應注意。此外其可以用來停止各種酶促反應。向酶促反應液中加入1/10體積的本製品，即可停止反應。
指示劑：10 × loading buffer 中僅有色素溴酚藍（Bromophenol Blue)一種染料（濃度0.05%）；6 X loading buffer 中含色素溴酚藍（Bromophenol Blue)、二甲苯腈藍FF（Xylene Cyanol FF)兩種染料（濃度都是0.05%），溴酚藍在瓊脂糖凝膠（1%）中約與300 bp的雙鏈線狀DNA的遷移速度相同，而二甲苯腈藍FF則與4000bp的雙鏈線狀DNA的遷移速度相等（不同濃度凝膠指示劑位置不同）
三、具體步驟
1、1%瓊脂糖凝膠電泳膠液的製備：稱取0.2g瓊脂糖，置於三角瓶中，加入20ml 1×TAE緩衝液，置於微波爐中30s+10s+10s加熱至瓊脂溶解
加熱溶解膠時待膠中起泡即可。
2、膠板的製備：將有機玻璃內槽洗淨，晾乾，放入制膠模具中，向冷卻至65℃（不燙手）左右的瓊脂糖凝膠中加入1ul Goldview後倒入有機玻璃內並在固定位置插入梳子。Goldview可以不按說明書要求加，如20ml瓊脂糖加0.5ul就可以了，尤其用於回收的膠，減少goldview的量可以減少對DNA的損傷。
3、應在室溫下慢慢凝固，形成均勻的孔洞，若在冰上使其迅速凝固，形成的孔洞不均勻，影響電泳
4、表面形成均勻的膠層，室溫靜置30min左右，凝固完全後，輕輕拔出梳子，將膠放入裝有緩衝液的電泳槽中
5、加樣：取5ul基因組DNA與1.2ul6×Loading Buffer 混勻後用移液槍點樣，每加完一個樣，換一個加樣槍頭，最後再點5ul的Marker 2000
1）加樣時用兩隻手操作，以防晃動。
2）若槍頭前有氣泡，應小心的將樣品推至槍頭的最尖端。
3）注意槍頭的尖端不可過深的插入孔道，以免將膠孔刺破。
4）DNA marker，每一條帶都是具有固定濃度（參見說明書），電泳完畢後，就可將目的DNA條帶和MARKER 條帶的亮度做個大致的比較，找出兩者最接近亮度的條帶。在通過目測DNA濃度的時候，最好要把加樣量設一個梯度，比如從0。5、2、4、6等，另外此方法也是判斷紫外分光光度儀測量核酸濃度準確性的一個依據。
6、電泳：一般在80-100v電壓下電泳，電泳直至溴酚藍指示劑到膠的三分之二處停止電泳。
7、觀察、拍照：將其放在紫外反射投射儀中觀察，並在凝膠成像儀中拍攝電泳圖片。
四、注意事項。
1、膠中所加緩衝液應與電泳槽中的相一致，溶解的凝膠應及時倒入板 中，避免倒入前凝固結塊。倒入板中的凝膠應避免出現氣泡，以免影響電泳結果（若出現氣泡，可用帶槍頭的槍將氣泡戳破）。
2 、 有時需要大的上樣孔, 可用膠帶把幾個相鄰的梳齒粘在一起, 這種情況下, 儘量讓膠液冷一些再倒膠。
3、如果只是為了看結果，不需要拍照或回收, 同一塊膠可重複用1-3次.
4、用保鮮膜包裹凝膠後放入4 度冰箱，或將凝膠浸泡在緩衝液中可保存數天。
5、若點樣後膠空中的樣品迅速消失，則證明膠孔具有漏洞，原因可能凝固時間太短（凝固時間至少30min）。
6、電泳緩衝液可以重複利用但必須能夠保持電泳所需的一定的離子強度和pH，否則應及時更新電泳緩衝液（尤其在恆壓條件下，電流過大時）。
7、為了防止電泳時兩極緩衝液槽內pH和離子強度的改變，可在每次電泳後合併兩極槽內的緩衝液，混勻後再用。
8、保證緩衝液淹過膠的上端1-2mm。緩衝液過多，電流則會從膠上部通過而不會通過凝膠，這樣會增加分離核酸所需的時間。
9、薄的凝膠電泳結果要好於厚凝膠，但易碎應小心操作
10、一般配1×TAE時不夠嚴格時,如濃度過大,電流就會增大.如果配得較稀,則電流會減小.另外電壓與電流的比例還會受電泳槽的長寬比的影響，如果電泳槽寬固定，長度增加，則電流與電壓的比會降低．
11、注意電泳期間，電泳槽蓋要安全蓋好，以防止液體蒸發，又可以降低被電擊的可能性。
12、電泳至溴酚藍至凝膠的三分之二時，即可停止電泳（實際過程中，跑至二分之一略多一點即可停止電泳）。
五、結果分析
1、DNA電泳的MARKER為什麼是扭曲的？ 電泳時電壓過高,可以在電泳前15分鐘用較低電壓(3V/cm),等條帶出孔後比較漂亮了.然後再調電壓。另外上樣時等樣品自然沉降後再加電壓。
2、電泳中產生的熱通常是由中心向外周散發的，所以介質中心溫度一般要高於外周，尤其是管狀電泳，由此引起中央部分介質相對於外周部分粘度下降，摩擦係數減小，電泳遷移速度增大，由於中央部分的電泳速度比邊緣快，所以電泳分離帶通常呈弓型。降低電流強度，可以減小生熱，但會延長電泳時間，引起待分離生物大分子擴散的增加而影響分離效果。所以電泳實驗中要選擇適當的電場強度，同時可以適當冷卻降低溫度以獲得較好的分離效果。
3、小片段的DNA電泳應採用聚丙烯醯胺凝膠電泳以提高解析度，上樣量過多會造成加樣孔超載，從而導致拖尾和彌散，對於較大的DNA此現象更明顯。
4、凝膠未完全凝固，點樣孔未固定好，導致條帶不規則。
5、加樣孔發亮：其中最主要的是非蛋白質/非核酸類的大分子雜質 (如多糖、多酚) 的殘留以及蛋白質和核酸的同步殘留。另外，樣品使用過量，也是一個重要原因。
6、膠的厚度增大會導致電壓過大
六、電泳膠圖自動編號軟體
1． 前言
筆者一直是做數據分析的，基本沒跑過膠，前兩天為了實驗需要，做了幾板膠圖。但是膠圖讀帶數膠孔的時候，我有些強迫症，每次數到一半就數亂了還要再重新數，一個膠圖要重數好幾次，這讓我抓狂了。於是我決心寫個程序來自動把編號添加到膠圖上，方便讀帶。經過兩天的努力寫了一個自動加編號的程序，結果如下圖，效果還是很好，數字位置標記很準確，再也不用擔心膠圖讀帶了。
雖然說自動，但是需要用滑鼠點幾下，是半自動的。我也想過通過模式識別，識別出膠孔，但是很難，而且膠圖的情況複雜，全自動不現實。
程序是用R語言寫的，需要使用者稍微有點R語言基礎。本文就不介紹R語言程序的安裝了。
2． 安裝
使用前先將add_num文件夾下所有內容下載到本地（https://pan.baidu.com/s/1dFolTZj）。
該程序運行前需要安裝一些R包，所需要的R包已經放在add_num文件夾下的『1_installPackage』文件夾裡。
打開R語言界面，將『1_install.R』的代碼複製到R命令窗口運行，會自動彈出一個文件選擇對話框，選擇『1_installPackage』文件夾下任意一個文件即可，就會自動安裝所需的包（如圖）。
當出現「Congratulates」的字樣時（如下圖），表明R包安裝成功，可以進行下一步了。R包只需要安裝一次即可。
3． 使用
代碼主要在2_add_num.R 裡，有個 add_num()的函數。
用法：
add_num(infile,nrow=1,start=0,end=25,cex=2)
參數：
infile： 膠圖文件名，支持png,tiff,jpg格式。
nrow： 添加編號的行數， 默認1。
start： 起始編號，默認0。
end： 最大編號，默認25.
cex： 字體大小，默認2.
下面講主要的步驟了！
1、運行 source(file.choose())
在彈出的對話框中選擇2_add_num.R
2、運行下面代碼
add_num(infile=file.choose(),nrow=4,cex=1.5)
在彈出的對話框中選擇需要添加編號的膠圖（膠圖所在路徑中不要有中文
字符），
3、出現『please click the first hole』時，點擊第一個膠孔的位置（箭頭指向，通常是Marker的位置），
4、按照提示分別再繼續點擊第一排最後一個點樣膠孔和第二、三、四排第一個膠孔（如下圖），結束後會出現「add number successful」提示，表明運行成功，在膠圖所在文件夾中會生成一個以「膠圖名稱_num」命名的標記好編號的膠圖圖片，大功告成！（註：這裡是在Rstudio裡運行該程序的方法，若在R程序中運行上述內容時，只需每次在膠圖上點擊膠孔後再點擊一下R Console」命令行界面即可，其他內容與在Rstudio程序裡運行方式完全相同。）
注意事項
1、在R和Rstudio裡均可運行該程序，但在Rstudio比R裡運行該程序更簡單方便些。
2、用熟練後不看提示，出現圖片後，依次點擊下面的位置即可。
4． 總結
該程序結合人工識別能很方便快捷添加膠圖編號，大大提高讀帶效率，並通過設置nrow, start, end 滿足不同的需求，使用簡單方便。
使用時請注意文件名不要有中文字符。
PS：該程序和教程由caumine@gmail.com原創，感謝其供稿。
七、電泳結果分析
PCR擴不出來由很多原因，每個細節都有可能導致擴不出來哦。首先重做一遍實驗，並且設陽性對照，讓同學幫忙看著，以防那個組分沒加，檢查PCR條件，並優化。如果還擴不出來，將PCR體系中的酶、dNTP、buffer全換新，並且換臺PCR儀器試試。實在不行，重新設計引物，一般我們都在設計巨多條引物時（幾百）才用primer5，你可以自己設計，按照這個網站http://www.idtdna.com/analyzer/Applications/OligoAnalyzer/計算Tm和hairpin的Tm(以小於30℃為佳)，這個是國外非常常用的。
（一）產量低或無PCR產物。
1.模板不完整。通過電泳檢測模板的質量。
2. 模板純度低。對於DNA模板，其中含有的酚(phenol）,乙二胺四乙二酸（EDTA）, 蛋白質及高金屬離子濃度（如Mg2+濃度）等汙染物會影響酶的活性而影響PCR反應。可以通過再次沉澱然後70%乙醇洗滌來進一步純化DNA。.
3.錯誤的引物設計。對於DNA模板的引物，可以使用相關軟體進行設計。
4.酶用量不足或效率低。酶應貯存在-20℃冰箱，現用現拿，避免酶長期暴露在室溫而失活，因此可以適當增加酶的用量，但酶用量過多會導致非特異性擴增。
5.引物用量不足或效率低。引物應貯存在-20℃，避免反覆凍融。構建PCR體系時一定在冰上操作，所有試劑都應插在冰上。
6.Mg2+量不足。如果Mg2+濃度過低，則會導致PCR產量降低。由於Mg2+濃度能夠受引物、dNTPs,模板的影響，故Mg2+濃度必須相應的進行調整以獲得最大產量。若模板中含有EDTA等金屬螯合劑時，必須相應提高Mg2+濃度（一分子的EDTA能夠結合一分子的Mg2+）。在某些需要高濃度的dNTPs的PCR反應中，由於dNTPs能夠結合 Mg2+形成複合體，故必須相應增加Mg2+濃度。
7.模板GC含量豐富。對於DNA模板，可以適當提高退火溫度。對於RNA模板，若GC含量豐富或具有二級結構，則可以適當提高一下反轉錄溫度。
（二）無特異性PCR產物。
1.錯誤的引物。重新設計引物。
2.在室溫下建立PCR體系。當PCR體系在室溫下建立時，Taq酶在建立的過程中表現為低的但是顯著性的活性，結果PCR反應中會出現非特異性擴增。為了避免這種現象若使用Taq聚合酶，須在冰上進行操作。也可使用熱啟動酶，該酶在室溫下沒有活性，只有處在高溫的PCR反應中才具有活性。
3. Mg2+濃度過高。如果Mg2+濃度過高，則會出現非特異性擴增。推薦的使用濃度為1—4mM。如果Taq Buffer 中含有KCl則起始的Mg2+濃度為1.5mM，如果Taq Buffer 中含有(NH4)2SO4，則Mg2+起始濃度為2mM。
4.模板量過高。在50ul體系中，對於質粒和片段DNA,最佳的模板用量為0.01—1ng，而對於基因組DNA則為0.1—1ug。過多的模板將導致非特異性擴增。
5.退火溫度不合適。為提高特異性，也可在最初的5個循環使用Tm高的引物作為Tm，後面的循環使用Tm低的，即採用Touch down PCR。
（三）PCR產物序列錯誤。
1.低保真度的耐熱DNA聚合酶。對於下遊的一些反應例如克隆、定點突變需要高保真度的DNA聚合酶，如pfu Polymerase。
２．Mg2+濃度過高。Mg2+濃度過高，就會降低PCR的保真性。推薦的使用濃度為1—4mM。標準的dNTP濃度為0.】
2mM的PCR反應，如果Taq Buffer 中含有KCl則起始的Mg2+濃度為1.5mM，如果Taq Buffer 中含有(NH4)2SO4，則Mg2+起始濃度為2mM。
３．非最佳的模板量。在50ul體系中，對於質粒和片段DNA,最佳的模板用量為0.01—1ng，而對於基因組DNA則為0.1—1ug。如果模板量過低，則會降低PCR反應的精確性。
4.暴露於紫外線下。為避免紫外線的傷害而造成序列的突變，可採用以下兩種方法一是在切膠的過程中用長波長的紫外線（360nm）二是需要回收的DNA在跑電泳時將同一樣品分兩道跑，一道跑大部分的DNA，另一道跑能夠在紫外線下分辨的DNA的量即可，在電泳結束後將含量多的用刀切下，少的用於紫外線下確定位置，然後通過比較將含量多的相同位置的膠切下用於回收。
5.錯誤的引物設計.
DNA 模板：避免兩對引物之間直接重複，鹼基對互補或自我互補，防止產生不需要的產物。
RNA模板：為了避免對基因組DNA的擴增，設計引物時位置應設在內含子和外顯子交界處。也可以使用DNase I從RNA中除去基因組DNA。
（四）PCR產物出現在陰性對照中。
1.提取RNA中含有基因組DNA的汙染，故在反轉錄前用DNAase Ⅰ將DNA消化。
2.錯誤的引物設計。
DNA 模板：避免兩對引物之間直接重複，鹼基對互補或自我互補，防止產生不需要的產物。
RNA模板：為了避免對基因組DNA的擴增，設計引物時位置應設在內含子和外顯子交界處。也可以使用DNase I從RNA中除去基因組DNA。
Refferences
1. Rand, K.N., Crystal Violet can be usedto Visualize DNABands during Gel Electrophoresis and to Improve Cloning Efficiency,Elsevier Trends Journals Technical Tips, Online,T40022, 1996.
2. Adkins, S., Burmeister, M., Visualization ofDNA in agarosegels and educational demonstrations, Anal Biochem., 240(1),17-23, 1996.3. Hu,G., DNA Cell Biol.,12, 763-770, 1993.
4. Longo, M.C., et al., Use of uracil DNAglycosylase to con-trol carry-over contamination in polymerase chainreac-tions, Gene 93, 125-8, 1990.
5.fermanent材料
八、在測序行業的主要應用
目前電泳技術在測序行業的應用主要有兩個方面：一、純化與檢測DNA，在提取完DNA之後要進行跑膠，看提取DNA質量如何。二、樣品測序之前，要對DNA進行打斷成要建文庫大小的片段，這裡還需要篩選出相應長度的DNA片段。
九、新的電泳技術
新的電泳技術其實原理和上面的一樣，不過是更準、更精確。比如：毛細電泳、脈衝電泳、雙向蛋白電泳等。
光學圖譜技術中採用的納米空道電泳,通過電泳讓DNA通過納米孔道，在這個過程中實施拍照，獲取其光學圖譜。
第六章 Southern Blot
實驗原理
Southern Blot用於凝膠電泳分離的酶切後DNA片段混合物中的特定性性片段（目標基因）的檢測 。首先提取基因組DNA，然後酶切切成小片段，使用吸水紙將凝膠中的DNA通過虹吸作用被轉移到尼龍膜上，然後用標記生物素的探針（核酸序列）與轉移到膜上的DNA進行雜交，最後通過顯色檢測目標基因的存在性。Southern Blot主要用於檢測目標基因的存在性及拷貝數多少，尤其用於檢測轉基因植物染色體基因組中是否已插入外源基因。
實驗準備
1.固相支持介質
常用的有尼龍膜（nylon）和硝酸纖維素膜（NC）其特點如下：
（1）正負電荷尼龍膜是較理想的核酸固相支持物，有多種類型；硝酸纖維素膜是目前應用最廣的一種固相支持物，價格最便宜。
（2）就結合能力而言：尼龍膜結合DNA和RNA能力可達480－600μg/cm2，可結合短至10bp的核酸片段；硝酸纖維素膜具有較強的吸附單鏈DNA和RNA能力，特別再高鹽條件下其結合能力可達80－100μg/cm2，對於200bp的核酸片段結合能力不強；
註：硝酸纖維素膜在低鹽環境下結合核酸能力不強，因此不適合用電轉移法。
（3）就結合方式而言：硝酸纖維素膜靠疏水相互作用來吸附核酸，容易被洗脫。而尼龍膜則通過離子鍵結合，結合牢固，不容易洗脫。
（4）就溫度適應性而言：尼龍膜經烘烤或紫外線照射後，核酸中的部分嘧啶鹼基可與膜上的正電荷結合；硝酸纖維素膜依靠疏水性相互作用結合DNA，結合不牢固；
（5）就韌性而言：尼龍膜較強；硝酸纖維素膜較脆，易破碎；
（6）就重複性而言：尼龍膜可反覆用於分子雜交，雜交後，探針分子可經鹼變性被洗脫下來；硝酸纖維素膜不能重複使用。儘管如此，尼龍膜一般也不反覆使用，避免可能的因素對結果產生影響
2..濾紙。購買大規格的濾紙。
3..託盤，玻璃板，直尺，鉛筆，保鮮膜。
4.fermentas探針標記檢測試劑盒，預雜交液二，及其它試劑（見試劑配製）
時間安排
第一天：基因組的提取及酶切：上午提取，下午檢測，測濃度，晚上酶切。
第二天：上午檢測酶切情況，並作濃縮，並跑上電泳；下午標記探針，配試劑，晚上轉膜。
第三天：上午繼續轉膜，下午預雜交，雜交。
第四天：上午洗膜檢測。
第五天：看結果。
實驗步驟
本實驗標準採用帶正電荷的尼龍膜。
（一）DNA提取參見實驗。註：提取完後，加入1/100體積的10mg/ml的RNAase，37℃處理40min，電泳檢測後把所有離心管中的DNA合成一管然後用快速核酸檢測儀測量DNA的濃度。
Southern雜交對基因組DNA的質量要求較高，用於Southern雜交的DNA必須長度完整，
大小在20kb-50kb之間，沒有剪切或降解。
（二）DNA酶切：對於基因組的酶切一般選用多種限制性內切酶，既可以單酶切也可以雙酶切或多酶切。選酶的原則是該酶在該基因內部無切點，且具有識別六個鹼基序列的核酸內切酶（eg：EcoRⅠ，BamH Ⅰ，Hind Ⅲ）這樣得到的酶切片段較大，易於吸附於膜上，不容易洗脫。同時應避免使用甲基化敏感的酶（eg：Pst Ⅰ，SalⅠ，XhoⅠ，ClaⅠ）酶切所需DNA的量一般為10μg～20μg，所需限制性內切酶量為10Unit酶/1μg
400μl的酶切反應體系：
10～30μg DNA
酶40ul（一般選取2—3種酶進行切割）
10×Buffer 40ul
BSA 40ul
無菌水至400ul
酶切體系大小的確定一般根據DNA量的多少確定，適當擴大酶切體系可以保證酶切完全。根據酶的使用說明書選擇相應的酶切溫度，酶切16h。取10ul電泳檢測酶切效果。正常電泳圖譜呈現一連續的彌散帶，但有時還經常可見到一些明亮條帶，這是重複序列而不是電泳假象。但是如果靠近點樣孔附近有一條明亮的帶，說明酶切不完全。如果泳道的邊緣較亮，說明點樣過大。如果泳道中間變寬，下段前緣變細小，說明是電壓較高造成。如果消化不徹底，可延長反應時間，但是一般不能超過20h。如果延長時間不湊效，可採用補充酶液再消化的策略。結果圖片如下：
註：
1. 建議使用TBE，緩衝能力強，產熱量少。另外goldview要少加，如40ml膠加1ul即可。
2. 膠板用長的，以適合長時間電泳，保證各種不同長度大小的DNA片段能夠更加有效的分離。
3.除酶切產物外，還應有marker，同時設置陰性（ck）、陽性對照（該基因的PCR產物或質粒），DNA。以對轉膜雜交過程進行檢測
4. 在進行大批量基因組DNA過夜酶切時，為避免酶長時間反應而導致活性的降低，最初加入的酶量應為所需量的1/2，酶切過夜後第二天早上再加入另一半，然後繼續反應1小時即可實現完全酶切。
5.為了避免型號活性（識別位點錯誤），注意所加酶的用量不能超過酶切體系的10%即甘油含量不能超過5%。
6.甲基化酶能使DNA 不被相應的限制酶所切割，導致酶切失敗。
（三）濃縮：加入1/10體積（40μl）3mol/L醋酸鈉(pH 5.2)2倍體積的冷無水乙醇（或0.6～1倍體積的預冷異丙醇）-20℃沉澱DNA30min，12000r/min,離心10min。加入70%冷乙醇1ml 12000r/min,離心10min，洗滌沉澱，乾燥，溶解於25μl 無菌水。
注：乾燥時一定乾燥至無酒精味為止，否則點樣時sample may float out of well。
（四）低電壓電泳：
1.關於酶切後電泳的點樣。由於酶切產物經過濃縮，故濃度相當大，所以在點樣時，上樣緩衝液不應按照稀釋至一倍即可，而應加大用量，否則將不能有效沉降DNA，而造成樣品損失。另外要適當加厚一下膠，防止樣品無法全部點入。
2.換用新的1×TAE或0.5×TBE電泳緩衝液和0.8%的瓊脂糖凝膠以小於1V/cm（20V
左右）的電壓電泳8—12h。電泳完成後，用凝膠成像系統拍照，若DNA沒能有效的分離，可以將凝膠放入電泳槽繼續電泳。
3.基因組樣品上樣時應使樣品在點樣孔中分布均勻後，再開始電泳，且最初電泳時應保持較高電壓，以保證樣品出孔。
（五）標記：修去凝膠邊緣和加樣孔上以及存在RNA的部分切下，並在Marker側，切去一小三角，作為凝膠方位的標記。並用直尺測量膠的長寬，確定其大小。
6，7，8步操作時一定要小心，保持膠的完整性。
6.脫嘌呤處理：對於大於20kb的條帶，可採用將凝膠置於0.2mol/L的HCl（無菌水配製）中搖晃之溴酚藍變黃（一般5—10min），二甲苯青變成黃色/綠色後，迅速將HCl倒入廢液缸，無菌去離子水洗滌數次。（強酸導致DNA脫嘌呤，能夠減小DNA的大小而有利於轉膜。但是，過度會導致DNA斷裂成較小片段。）註：凝膠是否需要脫嘌呤處理取決於DNA片段的大小，一般可根據marker判斷，如果序列>20kb，則需要脫嘌呤處理，從而保證轉膜的效率，如果序列<20kb則不必進行脫嘌呤處理，否則可能出現過嘌呤，導致DNA片段太小而不能有效結合到膜上。
註：如果實驗轉膜過程中同時含有大於 15kb的DNA(通常為基因組)和小片段DNA(通常是基因組酶切產物)，那麼在轉移的過程中傾斜容器，僅使凝膠上半部分浸泡於鹽酸，這樣既可以提高大片斷 DNA 的轉移效率，又不會打碎小片段DNA。
7.變性處理：加入數倍體積的變性液，每次15min，搖床處理兩次，然後無菌水衝洗。
8.中和處理：加入數倍體積的中和液，每次15min，搖床處理兩次，然後無菌水衝洗。
從DNA固定於膜上到其後的雜交，這一系列步驟的順序取決於膜的種類、轉移的方法以及固定的方法。在鹼性緩衝液中，DNA共價結合在帶正電荷的尼龍膜上，因此雜交前不需要固定。在中性緩衝液中轉移至不帶電荷或帶正電荷的尼龍膜上需要加熱固定或紫外交聯。本文以中性緩衝液為例，講述。
9.轉膜準備：
①、切一張每邊比凝膠大1mm的尼龍膜，並用乾淨的解剖刀切下膜的一角，與凝膠所切下的角一致。同時剪10張同樣大小的濾紙。（注意：需帶一次性PE手套和鈍頭鑷子，沾有油汙的膜不易浸溼。）
②將尼龍膜飄浮於盛有無菌去離子水的平皿中，直到其完全浸溼後（一般5min），將其浸入適20×SSC中30min，。（注意：膜的浸溼完全與否，對DNA的轉移至關重要。）而將10張濾紙浸泡在2×SSC中。
③將8張濾紙放在一片玻璃板上，形成比凝膠長且寬的支持物。將支持物放入一個大的託盤中，吸水紙兩端從板邊緣垂下。
④託盤中加入適當的20×SSC，直到液面幾乎與支持物表面平齊。當支持物上的濾紙完全浸溼後，用玻璃棒趕走吸水紙下的氣泡。
⑤將凝膠從中和液中取出，倒轉使原來的底面向上。放在支持物上（使凝膠儘量與底層吸水濾紙的邊同樣長或略短，見圖）。用玻璃棒趕走凝膠與吸水紙間的氣泡。
⑥用保鮮膜包繞凝膠四周，不要覆蓋有DNA的凝膠部分，以屏蔽轉移緩衝液從凝膠周圍短路流入吸水紙。（註：根據測量的凝膠的長度畫出凝膠形狀，然後在此基礎上再畫出一個每一邊都比前面略小的圖形。最後將保鮮膜放在這張紙的上面，然後象圖2那樣將保鮮膜固定，用刀片沿最後畫的圖形的痕跡將保鮮膜切下。然後這一保鮮膜既可用於封閉凝膠。）
⑦用適當的20×SSC溶液將凝膠溼潤。將溼潤的尼龍膜放置於凝膠上並使兩者的切角相重疊。為避免產生氣泡，當先使膜的一角與凝膠接觸再緩慢的將膜放到凝膠上。膜的一邊應恰好超過凝膠上部加樣孔一線的邊緣。膜一旦放在凝膠上就不要再移動了。
⑧在尼龍膜上放置10張與膜大小相同的濾紙，疊多疊衛生紙，將其放在濾紙之上，在衛生紙頂部放一400g重物壓實。註：不可壓過重的重物，因為這樣可能會使膠伸展彎曲變扁，從而使最終長度的判斷出現困難，且條帶變粗。
⑨轉移8～24h，並每隔2—3h更換浸溼的紙巾。儘量避免紙巾都被緩衝液浸溼。（對於大於16kb的24h以上）
⑩除去凝膠上的衛生紙和濾紙，翻轉凝膠以及與之接觸的尼龍膜，凝膠向上平放於乾燥的吸水紙上。用極軟的鉛筆在尼龍膜上標記記加樣孔的位置。
11將凝膠從膜上剝離，棄去凝膠。
13、紫外反射透射儀檢測凝膠上DNA的殘留量，用以確定轉移效率。
10.DNA的固定：
1、將膜浸入6×SSC，室溫放置5min，以除去粘附在膜上的凝膠碎片。
2、①真空烘烤固定：將膜從6×SSC中取出，並使多餘的液體流淨。將膜放在濾紙上室溫晾乾30min，將膜夾在兩張乾燥的濾紙中間，真空爐中85℃烘烤3h。（也可直接在雜交爐中烘烤）
②紫外照射交聯：將潮溼的膜放在一張乾燥的吸水紙上。254nm的紫外線照射使DNA交聯到膜上。（其原理是紫外線照射使DNA中的一小部分胸腺嘧啶殘基與膜表面帶正電荷的氨基基團之間形成共價交聯，但過量照射將導致大部分的胸腺嘧啶共價結合而降低雜交信號。同時，紫外線照射可能增強某些帶正電荷的尼龍膜的雜交信號背景，因而應當使膜上帶有DNA的一面朝向紫外。建議對潮溼的膜採用總量1.5J/cm2，乾燥的膜採用0.15J/ cm2。）
3、對於不立即用於雜交的膜都應充分乾燥，鬆弛的包於鋁箔紙或吸水紙中，室溫下最好保存在真空條件。或待膜冷卻後，用保鮮膜包好以後保存在4℃備用。
限於篇幅更多介紹參見：
Southern Blot雜交
第七章 基本實驗操作
分子生物學基本實驗操作
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