近日，瑞士一個科研團隊在已知新冠病毒基因序列的基礎上，通過反向遺傳學手段在酵母菌中快速構建出了活的新冠病毒。該技術能高效合成新冠病毒，尤其在新暴發病毒尚未被成功分離出之前，可以幫助科學家儘快向衛生部門和實驗室提供傳染性病毒毒株，且該替代方案更為高效、安全。
以上成果披露自預印本網站BioRxiv於當地時間2月21日發表了一篇名為「Rapid reconstruction of SARS-CoV-2 using a synthetic genomics platform」的論文。該尚未經同行審議。研究團隊首次在試驗中，利用合成基因組學平臺快速重建了新冠病毒。
值得注意的是，這是一項根據已知病毒基因組進行病毒重建的基礎研究工作，該成果與此前的謠言之一「新冠病毒是人工合成的」 無關，本研究中實驗室中構建的新冠病毒是在疫情暴發後，根據已經公布的病毒基因組序列進行的病毒重建研究。
該項研究的作者大多來自瑞士伯爾尼大學的科學家，他們聯合德國、俄羅斯多所科研院校與相關衛生機構共同完成了上述成果。
研究團隊認為，利用已知的病毒基因組序列，通過反向遺傳學手段快速構建出了新冠病毒，可以成為向衛生部門和實驗室提供傳染性病毒毒株的替代方法，還可以對單個基因進行遺傳修飾和功能表徵，從而爭取時間對疫情暴發做出快速反應。
論文中提到，反向遺傳學被認為是一種不可或缺的工具，它徹底改變了我們對病毒發病機制和疫苗開發的認識。大型的RNA病毒基因組，如冠狀病毒基因組，由於基因組較大且不穩定，很難在大腸桿菌宿主中克隆和操作。研究團隊此次報導了一個基於酵母的合成基因組學平臺，用於多種RNA病毒的基因重建，包括冠狀病毒科、黃病毒科和副粘病毒科的成員。
研究人員可利用病毒分離物、克隆病毒DNA、臨床樣本或合成DNA生成病毒亞基因組片段，然後使用轉化偶聯重組技術 (TAR)克隆技術將基因組維持為酵母人工染色體(YAC)，從而在釀酒酵母中實現一步重組。T7-RNA聚合酶被用於產生病毒RNA，進而可以產生活病毒。
研究團隊首先在其他RNA病毒(如鼠肝炎病毒MHV)中檢驗了這一平臺的準確度，團隊測試了鼠肝炎病毒A59株中含有綠色螢光蛋白(MHV GFP)的基因克隆能力，結果表明測試的克隆中正確組裝了MHV基因組的YAC佔90%，這表明病毒在酵母中的組裝效率很高。
也正是利用該平臺，研究人員在拿到合成DNA片段後一周內，對新冠病毒進行了工程改造和復活。
病毒cDNA克隆及重組SARS-CoV-2和SARS-CoV-2-gfp的重建
具體來看，研究團隊將病毒基因組分成12個片段，大小在0.5kbp-3.4kbp。同時，為了便於血清學診斷和在細胞培養時追蹤，研究團隊將合成新冠病毒設計成可以表達GFP(綠色螢光蛋白)。因此，研究團隊又將片段11分成3個包含GFP序列的子片段，GFP序列被插入ORF7a(開放閱讀框，ORF)中從而在總計有14個片段。
研究團隊讓試劑公司化學合成上述14個DNA片段，1月14日下訂單，2月4日拿到其中的12個片段。片段5和7在大腸桿菌中的克隆出現一些問題未能完成。不過，研究團隊恰好同時獲得了慕尼黑一位患者的新冠病毒樣本(SARS-CoV-2/München1.1/2020/929)，他們決定利用RT-PCR擴增獲得片段5和片段7。
利用TAR克隆，對於所有6種新冠病毒構建體，研究人員都獲得了正確組裝的分子克隆。隨後，利用轉化偶聯重組技術 (TAR)，用酵母菌的同源重組系統依據末端重複的序列，將這些DNA序列拼到一起。獲得完整的病毒序列後，用T7 RNA聚合酶將這一DNA序列轉錄為病毒RNA，將該RNA用電穿孔技術導入到VeroE6(猴腎細胞)中，使得細胞被感染，培養這些細胞的上清液(含釋放出的病毒顆粒)注入到別的培養基中，可以感染別的細胞。
研究團隊進而表示，「我們能在獲取病毒的合成DNA片段後僅一周的時間內，對最近流行的新冠病毒的化學合成克隆進行工程改造和復活。」病毒的重組有很高的效率和準確度，通常情況下，超過90%的克隆是正確的。
值得注意的是，作者們指出，儘管此前在酵母中進行同源重組已被用於很多分子病毒的克隆，但這一研究在對通過這種方法快速生成大型RNA病毒的全長cDNA的可行性進行了全面評估，尤其是這種大型RNA病毒在大腸桿菌中無法被穩定克隆。
利用合成基因組學平臺克隆RNA病毒基因組
值得注意的是，除新冠病毒外，研究團隊還報導了利用該技術合成構建MHV(鼠肝炎病毒，一種冠狀病毒)和MERS-Cov等，HCov-229E和Zika病毒的構建仍在實驗進行中。
來源：澎湃新聞 編輯：沈晨