2020年10月，來自弗萊堡大學物理研究所的Gerhard Stock課題組和蘇黎世大學化學系的Peter Hamm課題組合作在PNAS上發表了題為「Real-time observation of ligand-induced allosteric transitions in a PDZ domain」的文章，介紹了一種實時觀察配體誘導的別構轉變的方法，使用PDZ2作為模型體系進行研究。
——背景——
別構表示蛋白質或者蛋白質複合物中兩個位點的耦合，當配體與遠端位點結合後能夠改變活性位點的親和力。由於生物學功能與蛋白質結構密切相關，配體誘導的蛋白質功能變化通常與蛋白質平均結構的變化相關。另一方面，配體的結合也可能會改變蛋白的柔韌性，從而改變結構的變化並為自由能提供熵的貢獻，稱為「動力學別構」，已經被用於解釋配體結合後沒有明顯構象變化的情況。研究動力學別構的方法主要是NMR光譜學，但是這僅能解釋平衡動力學。
儘管結構上的變化和動力學上的變化這兩個模型似乎都是合理的，但是「別構信號」的性質還不清楚，所以需要去研究別構的成因。這主要包括三個步驟：1）配體的結合，2）導致蛋白質的原子經歷非平衡的時間演化，3）最終導致蛋白質遠端位點的結合親和力發生變化。這被稱為「變構轉變」，是一個非平衡過程，僅在極少數情況下能直接觀察到，一方面是因為結構變化的微小性使得轉變途徑難以通過實驗觀察，另一方面是因為分子動力學（MD）模擬的時間尺度的限制。本文主要是發展了一個研究前兩個步驟的方法，以PDZ2結構域作為模型體系來研究配體誘導的別構轉變。
——結果——
由於PDZ結構域結合配體以後的構象變化很小，所以是研究動力學別構的一個很好的例子。PDZ結構域介導的相互作用在許多信號轉導複合物中起著關鍵作用。PDZ結構域中的別構信息流被認為是通過蛋白質中保守的別構網絡進行傳導的。此處考慮的體系是來自hPTP1E(human tyrosine phosphatase 1E)的PDZ2結構域和連接有偶氮苯部分作為光控開關的RA-GEF-2肽衍生物(Ras/Rap1 associating guanidine nucleotide exchange factor 2)(圖1)。通過對偶氮苯部分進行光異構化，可以在精確定義的時間點改變配體的結合親和力。作者將時間分辨振動光譜法與同位素標記策略結合使用，以實時監測蛋白質的結構變化，並執行大量的（大於0.5 ms的總模擬時間）全原子非平衡MD模擬與Markov建模相結合來解釋根據系統的結構演變得出的實驗結果。他們發現該蛋白質的平均結構變化相當小。但是，在實驗和MD模擬中，蛋白質的自由能表面都可以以少量的亞穩態構象狀態為特徵。與將別構作為亞穩態狀態的相對群體之間的相互轉換的觀點相一致，他們看到配體誘導的PDZ2結構域的響應如何最好地描述為自由能態的重塑，以及該響應如何從配體傳導到蛋白而不會引起蛋白質結構上的明顯變化。
圖1. 配體轉換的PDZ2結構域。在光控開關（紅色）的反式構象中，配體（藍色）在結合口袋中結合的很好，而當轉換為順式時配體開始移出。
作者利用醯胺I條帶範圍內的瞬態紅外光譜研究配體誘導的構象轉變。該帶主要來自肽/蛋白質主鏈的C=O拉伸振動，並且具有強烈的結構依賴性。儘管無法從醯胺I條帶確定蛋白質的結構，但是蛋白質結構的任何變化都會在該條帶中引起微小但明顯的變化（圖2A–C）。圖2顯示了在trans-to-cis（圖2D–F）或cis-to-trans（圖2G–I）進行光轉換後，醯胺I振動光譜區域中的瞬態IR響應。選擇性同位素標記可用於區分肽配體與蛋白質的貢獻。兩種同位素的瞬時IR響應看起來都非常相似，因為該信號主要由可光轉換的肽控制，該可光轉換的肽直接受到偶氮苯部分的幹擾。圖2的右圖顯示了移除可光轉換肽配體貢獻的double-difference光譜。總體而言，這些double-difference光譜的動力學非常複雜，並且涵蓋了多個時間尺度。此外，trans-to-cis（圖2F和3A和C）與cis-to-trans轉換（圖2I和3B和D）的響應不是彼此的鏡像，這可能暗示蛋白質在相反方向上採取相同的途徑。
圖2. PDZ2在醯胺I條帶區域的瞬態紅外光譜。D–I中的紅色表示正吸光度變化，藍色表示負吸光度變化。
圖3A–D中的紅線是使用最大熵方法對信號進行時間尺度分析得到的擬合曲線。時間尺度譜在圖3A–D中顯示為藍線。上面討論的每個動力學過程在這些時間尺度譜中都顯示為一個峰，並且圖3A–D中所示的所有例子的峰圖都不同。儘管如此，動力學特徵似乎表明相對較少的離散時間尺度(圖3E–F)。
圖3. 進行trans-to-cis（左）和cis-to-trans（右）轉換時，在1,636 cm-1（A和B）和1,579 cm-1（C和D）處的瞬態13C15N-WT差異數據，突出的特徵標記為圖2中的1至 3。E和F顯示了相應的動力學特徵。G和H顯示了分子動力學模擬的動力學特徵，它是通過對平均Cα距離的非平衡時間演化的時間尺度分析獲得的。
圖4A顯示了從5×5 s長的反式平衡模擬中獲得的自由能表面，該模擬描述了PDZ2的配體結合態。自由能態揭示了四個定義明確的局部最小值，表明系統的亞穩態構象狀態。基於密度的聚類確定狀態1接近晶體結構，而狀態2則表示結合口袋的開放狀態。圖4A和B揭示了cis中可及的構象空間大大增加，並且狀態5的出現顯示了結合口袋的進一步打開。圖4D顯示了配體的光控開關引起了狀態群體的顯著轉移，主要是從狀態1轉移到狀態2和5。為了說明與這些狀態相關的構象變化，圖4E顯示了狀態1和2以及cis中特有的狀態5的能量最小結構的疊加圖。圖4F顯示了主要狀態對應的蛋白質結構以及配體的位置密度。
圖4. 確定亞穩態的構象狀態。從PDZ2的trans（A），cis（B）和無配體（C）平衡模擬中獲得的自由能態圖，是兩個基本殘基間距離的函數。
——小結——
總的來說，本文結合瞬態紅外光譜和非平衡的分子動力學模擬，描述了PDZ2結構域中的配體誘導的構象轉變，這種構象轉變被認為是造成蛋白質別構通訊的原因。此外，本文的結果暗示純動力學驅動的別構和構象變化驅動的別構不像之前認為的分的很開，兩者之間可能存在相互作用從而允許蛋白根據傳入的信號調整它們的自由能態。本文介紹的光控開關方法用途非常廣泛，可以讓我們了解別構通訊中的「時間」和「速度」。
參考文獻：
Bozovic, O., et al. "Real-Time Observation of Ligand-Induced Allosteric Transitions in a Pdz Domain." Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 117.42 (2020): 26031-39.
DOI: 10.1073/pnas.2012999117
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作者： 謝娟
審稿：黃喬靖
編輯：林康傑
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