流式螢光染料分哪幾類?

流式細胞學的發展，最重要的促進力量是抗體，其次就是與儀器檢測能力配套的螢光染料。螢光染料目前仍跟不上儀器檢測通道數量的發展。

現有的流式螢光染料可分為以下11大類：

1、有機小分子

提起有機小分子，大多數人肯定一頭霧水，但是如果我舉出幾個例子，肯定恍然大悟。

FITC（分子量389 Da）、Alexa Fluor 488（FITC類似物，分子量643 Da）、Texas Red（TxRed，分子量625 Da）、Alexa Fluor 647（分子量1155 Da） 、Pacific Blue（分子量242 Da）和Cy5（分子量762 Da）。是不是基本上都用到過？

這些有機小分子具有一致的發射光譜和較小的斯託克斯位移（激發波長和發射波長之間的差，大約為50-100 nm），光穩定好，容易與抗體偶聯，所以應用廣泛。

值得一提的是Alexa Fluor染料光穩定性較FITC更好，所以如果要做成像的話，可選擇它們。

2、藻膽蛋白

藻膽蛋白（Phycobiliproteins）是從藍藻、鞭毛藻等藻類中提取的大蛋白分子，例如藻紅蛋白（PE）的分子量為240,000 Da。這些蛋白質具有較大的斯託克斯位移（75-200 nm），並且具有穩定的發射光譜。由於藻膽蛋白較大，因此它們在結合過程中通常具有1：1的蛋白質與螢光染料比率，因此對於定量流式細胞術非常有用。

但是，藻膽蛋白易受光致漂白，因此不建議長時間或反覆暴露於激發光源中。

藻膽蛋白家族中，除了藻紅蛋白（PE）外，還有別藻藍蛋白（APC）和苦瓜素葉綠素蛋白（PerCP）。

3、量子點

量子點（Qdots）是半導體納米晶體，具有與納米晶體尺寸密切相關的螢光發射光譜。它們最適合被紫外或紫光激發，但也容易被其它雷射少量激發，因此，在多參數實驗中使用Qdots時，其它波長雷射器的這種微小激發，卻會使螢光補償變得複雜。

正是如此，雖然量子點染料亮度高，但由於這些補償問題難以解決，並且將Qdot結合到抗體上較為困難，所以這些試劑在多參數方案中大多被高分子染料取代。

4、高分子染料

高分子（聚合物）染料由收集光信號的聚合物鏈組成，可以根據聚合物鏈的長度和連接的分子亞基，「調節」吸收和發射特定波長的光。這些染料非常穩定，並且與藻膽蛋白具有相似的量子效率，光穩定性大大提高。

由於可以使聚合物染料僅吸收特定波長的光，因此避免了Qdots存在的跨波長激發的問題。

高分子染料中典型的代表是Brilliant Violet (BV)、Brilliant Ultraviolet (BUV) 和Brilliant Blue (BB)。

5、串聯染料

串聯染料將藻膽蛋白（PE，APC，PerCP）或高分子染料（BV421，BUV395）與有機小分子螢光染料（Cy3，Cy5，Cy7）化學偶聯，利用螢光能量轉移（FRET），形成單雷射激發更多波長的發射光。

例如，Texas Red的最大激發為589 nm，而PE的發射為585 nm，因此通過將PE與Texas Red耦合，PE的發射光通過FRET激發Texas Red，從而使PE-TxRed可用488 nm或532 nm的雷射器激發。

高分子抗體也可使用相同的方法串聯有機小分子染料。

串聯染料非常亮，具有較大的斯託克斯位移值（150-300 nm），這在檢測低密度的抗原時非常有用。但是，串聯染料的穩定性不如供體螢光染料，並且能量轉移效率因批次而異，使補償複雜化。

6、重金屬離子

重金屬離子嚴格說起來不算螢光素，但是我們也在此一起提一下。

用於質譜流式的抗體，不是用螢光素結合的，而是與鑭系元素系列中的單個同位素重金屬離子結合。目前商業上有35種鑭系元素同位素可用於抗體偶聯。這些探針是非螢光性的，僅適用於質譜流式分析。

7、螢光蛋白

螢光蛋白經常用作基因表達的報告系統。最常用的是來自維多利亞水母（Aequorea victoria）的綠色螢光蛋白（GFP）。由此衍生出CFP和YFP。

紅色螢光蛋白（DsRed）來自蘑菇海葵Discosoma，從DsRed衍生出下一代單體螢光蛋白（mCherry，mBanana），並具有更寬的激發和發射光譜。

隨著基因克隆技術的成熟，目前螢光蛋白已有數百種，其激發和發射光譜範圍從紫外線到近紅外。

8、核酸染料

核酸染料結合DNA、RNA或兩者均結合。它們可用於定量DNA進行細胞周期分析（如PI，7-AAD，DyeCycle Violet，DAPI），分選染色體（如Hoescht 33342， Chromomycin A3），利用側群分析對幹細胞進行分選（如Hoescht 33342），死活細胞區分以及對細菌進行分選。

將核酸染料與另一種標記物（例如螢光染料偶聯的抗溴脫氧尿苷（BrdU））結合使用，能確定增殖水平。

9、細胞增殖染料

用BrdU（溴脫氧尿嘧啶核苷）孵育細胞，使其摻入細胞DNA合成過程，然後用針對BrdU的抗體和DNA染料染色，便可測量細胞增殖。但是，此方法不適合長期增殖研究。

羧基螢光素琥珀醯亞胺酯（CFSE）可用於跟蹤增殖細胞的多次分裂。CFSE染料的紅色和紫色變種現在也已經有了。這些染料在合適的濃度下，不影響細胞生長或形態，適合長期增殖研究。

10、細胞死活染料

細胞活力可以通過排除性染料（如碘化丙啶、DAPI）確定，也可通過染料與細胞內胺類物質的結合檢測。

排除性染料不能固定，僅適用於無感染性且需立即分析的細胞。

胺類染料包括Live/Dead（ThermoFisher），Zombie（Biolegend）或Fixable Viablity（BD Biosciences），適用於固定的細胞，因此適合那些有傳染性細胞、胞內抗原染色的細胞、多聚甲醛固定的細胞。

11、鈣指示劑染料

鈣指示劑染料與鈣結合後會發生色移，可用於指示細胞激活和信號傳導。

最常用的染料仍然是indo-1，即紫外雙相鈣探針。另外還有fluo-3的Blue-green calcium probes。

文獻來源：Current Protocols in Immunology，Chapter 5.1.4, Flow Cytometry: An Overview

插圖搜自Google圖片

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