在這麼多的情況下需要對細胞進行固定，那您有考慮過如下的這些因素嗎？
在文中，我們將探索細胞固定過程當中的一些影響因素。
本文主要是討論較為常見的多聚甲醛對細胞的固定，更多的固定方式的注意事項將會在以後的微信文章中作介紹。我們常說的PFA，是在流式中使用最多的固定劑。實際上，PFA指固體形式的甲醛多聚物，在溶於溶液中後分解為單體形式的水溶液。所以，我們常說的PFA固定劑是甲醛的單體溶液，PFA和甲醛溶液兩者是相同的含義。
在流式實驗中，PFA的常用濃度是1%-4%。在處理傳染性樣品時，0.37%的PFA就能對來自HIV感染的病人樣品進行有效地消毒。在1% 的PFA中孵育45到60分鐘，或者在4%的PFA中孵育15到20分鐘，均能對細胞起到足夠的固定作用。這樣處理之後的細胞既能夠用於後續實驗（如胞內染色）或者暫時儲存以備日後使用。
在常規的流式染色過程中往往會包含表面標記物的染色，那麼如何確定在表面染色之前固定還是在表面染色之後染色呢？
如果您是想分析胞內因子的磷酸化水平時，可能某些表面抗原和抗體的識別會導致信號傳導，即便是短時間的接觸，也會改變胞內因子的磷酸化水平。那麼在這種情況下，您需要在加入表面染色抗體之前對細胞進行固定，這也是在我們的True-Phos™ Perm Buffer產品設計時，推薦在分析胞內磷酸化蛋白時優先對細胞進行固定然後進行表面染色的原因。凡事都有兩面性，先固定再染色和先染色再固定都有各自的優勢和劣勢，以下因素都是應該在不同的例子中考慮。
固定可能會使抗原的表位結構發生改變，抗原和抗體之間便可能無法相互結合。以下的例子就是在固定之後導致信號缺失：
用PFA固定或者不固定的細胞用相應抗體進行染色的對比
這種現象和您選擇的抗體克隆號密切相關，因此您在做實驗之前就需要搜集更多關於不同克隆號的抗體的信息，查看特定克隆號的抗體是否會受到影響。當然，我們搜集了一些關於不同克隆號的抗體在4% PFA固定後的表現情況，詳情請見https://www.biolegend.com/fixation。網頁上未列的抗體，您可能需要參考相應的參考文獻。
先染色後固定的情形下，由於螢光素是共軛結合在抗體上，他們也一同被固定，這就可能造成螢光素的信號部分丟失。像PE和APC這類蛋白染料，尤其是相應的耦合染料（例如PE/Cy7和APC/Cy7），在固定之後有可能發生螢光淬滅。儘管這些螢光蛋白理應能夠禁得起1%-4%的PFA的固定作用，但是一些更強的固定劑，如酒精就很容易影響到這些染料的信號。在這種情況下，我們推薦實驗中選擇使用化學合成染料（例如Alexa Fluor®及Brilliant Violet™系列染料）。這些染料能夠更好地抵抗固定劑對螢光信號的影響，或者您也可以選擇先固定再染色。
為了應對固定而造成的耦合染料斷裂問題，BioLegend提供專用的FluoFix™ Buffer。這是一種基於PFA，卻能改善耦合染料斷裂的固定劑。
現在，您已經知道了在流式過程中關於固定的一些知識，是時候展示真正的實力了！
如有關於固定處理的其他問題，歡迎來信諮詢（tech-china@biolegend.com）。