原文標題: Iron-Only and Vanadium Nitrogenases: Fail-Safe Enzymes or Something More?
發表期刊：Annual Review of Microbiology
影響因子：11.00
發表時間：2020.08
第一作者：Caroline S. Harwood
通訊作者：Caroline S. Harwood
第一單位：Department of Microbiology, University of Washington
原文連結：
https://doi.org/10.1146/annure釩micro-022620-014338
編譯：於安瀾 雲南大學國際河流與生態安全研究院
鉬固氮酶是一種將大氣中的氮氣轉化為氨的酶，它對生物圈氮循環和生命的可持續性具有重要意義。在古細菌和細菌中也發現了與鉬（鉬）固氮酶同源的釩固氮酶和鐵固氮酶，它們在活性位點上以釩或鐵作為過渡金屬。到目前為止，只在擁有鉬固氮酶的微生物中發現了替代固氮酶。它們在細菌和古菌中的分布不如鉬固氮酶廣泛，效率也較低。人們一直以來認為替代固氮酶是在鉬含量有限的情況下使用的安全酶。最近的研究表明，釩固氮酶可能在全球生物氮循環中發揮作用，而鐵固氮酶可能有助於形成自然界微生物群落相互作用的產物。
全球生物氮循環是由大氣氮氣（N2）還原為氨（NH3）推動的，氨是一種生物可以直接利用的氮存在形式，很容易被轉化為硝酸鹽等其它形式的氮，是植物的首選氮源。生物固氮是由固氮酶催化的，固氮酶是一種複雜的氧敏感金屬酶。N2三鍵的還原是一個極其難以發生的反應，是一個完全由特定細菌和古生菌所承擔的生物化學過程。所有的固氮微生物都會合成一種鉬固氮酶，它的活性部位有一種獨特的鉬鐵輔因子。鉬固氮酶是由鐵蛋白（nifH編碼）和鉬鐵蛋白（nifDK編碼）組成的雙組分酶。鉬鐵蛋白是一種由兩個α亞基和兩個β亞基組成的異四聚體（圖1a）。
圖1. 三種形式固氮酶的示意圖。
鉬固氮酶催化的總反應為
N2+ 16ATP + 8e−+ 8H+→ 2NH3+ H2+ 16ADP + 16Pi
從這個公式可以看出，固氮是一個ATP密集型反應，它還需要大量的質子和以高能量電子形式存在的還原劑。氮氣還原為NH3是很難實現的，因為儘管它在熱力學上是有利的，但對催化來說有一個很大的必須克服的活化能障礙（圖2）。由於其催化反應的複雜性，固氮酶的周轉速率很低。由於這些原因，在某些情況下它需要大量合成佔細胞總蛋白高達10%的固氮酶，以維持在固氮條件下的生長。
圖2. 氮氣還原所需要克服的活化能障礙。
在20世紀80年代發現，棕色固氮菌（Azotobacter Vinelandii）可以表達不含鉬的固氮酶，這導致了釩和鐵固氮酶的發現有了初步描述。這些酶由VnfHDK和AnfHDK亞基組成，它們與NifHDK亞基固氮酶是同源的，但它們的活性位點有FeV或FeFe輔助因子。其它的固氮酶還包括VnfG和AnfG亞基作為附加成分（圖1a）。到目前為止，替代固氮酶只在含有鉬固氮酶的微生物中被發現，很可能是因為它們依賴於Nif蛋白輔助因子的生物合成和組裝，而Nif蛋白也是鉬固氮酶合成所必需的。與鉬固氮酶相比，釩和鐵固氮酶的效率較低，分布範圍也較小。
根據最近的研究，替代固氮酶催化的反應如下：
鐵固氮酶：N2+ 40ATP + 20e−+ 20H+→ 2NH3+ 7H2+ 40ADP + 40Pi
釩固氮酶：N2+ 24ATP + 12e−+ 12H+→ 2NH3+ 3H2+24ADP + 24Pi
這三種固氮酶都會產生氫氣（H2），這是固氮的固有產物。然而，其它的固氮酶，特別是鐵固氮酶，每次N2還原比鉬固氮酶產生更多的H2。基於此提出了固氮酶可能被用來產生氫氣作為生物燃料的建議，而且已經有大量針對這一應用的研究。
替代固氮酶在體外的相對低效引發了人們的疑問，即它們是否對全球生物固氮有貢獻，以及它們在自然界中是否具有除固氮之外的其它功能。最近的數據表明，釩固氮酶在體內可以和鉬固氮酶一樣有效，至少在某些情況下在某些細菌中是這樣的。然而，人們一直認為，當鉬在環境中受到限制時，替代固氮酶在確保微生物能夠獲得可利用的氮方面起到了故障保護作用，這一點有直接和間接的證據。還有一些有趣的研究認為，替代固氮酶可以在防止細菌過度減少和碳轉化方面發揮其它作用。在這兩種可供選擇的固氮酶中，釩固氮酶從生化角度得到了更廣泛的研究，這為闡明鉬固氮酶的作用機制提供了新見解。鐵固氮酶受到的關注要少得多，但最近的研究表明，它具有獨特的性質，包括產生大量甲烷（CH4）的能力，這是其它兩種固氮酶所不具備的。在此，我討論目前已知的鐵和釩固氮酶的合成，以及它們在鉬固氮酶的背景下的活性，鉬固氮酶在編碼替代固氮酶的相同微生物中工作。本文重點介紹了固氮酶的生物學作用及其在體內的調節和活性。
最近一項以anfD、vnfD或nifD基因為代表的古生物和細菌全基因組中三種固氮酶的分類分布調查中發現，在古生界中，只有嗜氫基因的產甲烷菌（Eurya chaeota的成員） 固氮菌。約18%的真毛細胞基因組編碼鉬固氮酶，37%的基因組編碼釩固氮酶，約14%的基因組編碼鐵固氮酶。到目前為止，對古生界成員的替代固氮酶的生化或生理研究很少。完全測序的細菌基因組包括34個門，其中10個門中的一些細菌編碼nifD基因，3個門中的一些細菌編碼vnfD基因，5個門中的一些細菌編碼anfD基因。在4342個完全測序的細菌基因組中，7.4%編碼鉬固氮酶基因，10%編碼鐵固氮酶基因，4%編碼釩固氮酶基因。微生物資料庫中替代固氮酶基因的數量可能受到相對於其它細菌相對較多的厚壁菌門和變形菌門基因組測序的影響。在固氮菌中，芽孢桿菌、梭狀芽孢桿菌和其它屬都有鐵固氮酶基因（61個），但這一門的成員幾乎沒有關於其替代固氮酶的活性和調節的研究。研究得最好的替代固氮酶來自變形菌門的成員，特別是維納蘭迪氏菌和幾種紫色的非硫光養細菌。目前在藍藻中除了發現鉬固氮酶基因外，還發現了釩固氮酶基因。多變魚腥藻（Anabaena variabilis）ATCC 29413的釩固氮酶基因已有較深入的研究，在與其關係密切的髮菜屬植物中也廣泛存在，其中許多是苔蘚植物的共生體，包括苔蘚和角藻。
一些微生物編碼所有三種固氮酶同工酶。例如產氫甲烷的乙酸鏈黴菌、好氧的γ變形菌和沼澤紅假單胞菌。對16個近緣菌株的基因組調查顯示，不同的菌株具有不同的替代固氮酶基因（74個）。所有菌株均編碼鉬固氮酶和鐵固氮酶，只有13株編碼釩固氮酶。在對其它4株親緣關係較遠的紅假單胞菌的研究中，4株紅假單胞菌都有鉬固氮酶基因，其中2株也有僅含鐵的固氮酶基因。這種類型的替代固氮酶基因在密切相關的細菌中的不均勻分布與橫向基因轉移事件是一致的。事實上，最近有報導在苔蘚植物的幾種藍藻共生體中攜帶vnf基因。
目前為止，尚未在與豆科植物形成根瘤的共生固氮菌，以及與苜蓿、三葉草、豌豆和其它豆科植物共生的根瘤菌中發現替代固氮酶。研究表明，這些細菌不太可能缺乏鉬，因為它們的寄主植物可以從深層土壤甚至礦物質中獲得並濃縮這種微量元素。這將不再需要替代固氮酶來支持植物生長。另一種可能性是，僅含釩和鐵的固氮酶效率低下，使植物共生體無法利用它們來支持植物的生長。
許多研究已經使用PCR和適當的引物來鑑定環境樣品中的nifH序列，作為含鉬固氮酶細菌存在的生物標記物。然而，NifH和VnfH蛋白關係密切，胺基酸序列同源性高達95%，因此這些研究可能在不知不覺中發現了釩固氮酶基因。為了認識到這一點，最近的一項研究使用了anfD-和vnfD-特異性引物，在佛羅裡達大沼澤地的沉積物和落葉中，以及西佩維塞特沼澤（法爾茅斯,麻薩諸塞州）的沉積物中確定了替代固氮酶基因。對nifD、anfD和vnfD序列多樣性的分析表明，具有替代固氮酶的已知細菌類群數量增加了約20倍，主要是在屬和種水平上。
已有關於鉬固氮酶進化的論文，隨著更多的固氮酶基因序列的出現和AS的出現，這些分析變得更加精細。推斷蛋白質關係的工具已經有所改進。在一項考慮了替代固氮酶進化的研究中，對串聯的NifHDK、VnfHDK和AnfHDK蛋白進行了貝葉斯和最大似然系統發育分析，得到了三種固氮酶同工酶都在統計上良好地支持了譜系同源性。有兩個明顯的鉬固氮酶亞系被發現。一種是來自產甲烷古細菌的蛋白質，另一種是細菌和古菌的鉬固氮酶的混合物。位於兩個NIF亞系之間的是釩固氮酶的單系譜系，鐵固氮酶是一個分支。這一分析支持這樣的觀點：釩固氮酶可能是由鉬固氮酶進化而來的，可能是在基因複製事件之後，而鐵固氮酶可能是從釩固氮酶進化而來的。
蛋白質序列比較明顯的可以看出所有三種固氮酶同功酶都有相同的基本結構，不同的固氮酶中添加了AnfG和VnfG亞基（圖1a）。AnfG和VnfG亞基的功能尚不清楚，但它們是活動所必需的。NifH/VnfH/AnfH蛋白（固氮酶）約63 kDa，NifDK/VnfDK/AnfDK蛋白（固氮酶）約230 kDa。鉬固氮酶還原酶是一種同源二聚體，在與兩個ATP的水解相偶聯的反應中，一次向鉬鐵固氮酶傳遞一個電子。電子一次一個地從NifH中的4Fe-4S團簇傳遞到二氮原酶還原酶（NifDK）中被稱為P團簇的8Fe-7S金屬團簇。電子從P團簇轉移到FeMo輔助因子，即底物還原位置。在過去的38年中，鉬固氮酶的多種晶體結構已經被獲得，這些晶體結構揭示了金屬團簇的組成和配位，以及對催化很重要的FeMo輔助因子的特徵。2017年報導了釩固氮酶的第一個結構，這項研究和其它研究表明，FeV輔助因子的基本設計和組成與鉬鐵7S9C-高檸檬酸輔助因子相似，但不完全相同（圖1b）。已知的與NifH蛋白中4Fe-4S簇配位的胺基酸殘基以及NifDK亞基中的P[8Fe-7S]簇和FEMO輔因子在相應的VnfHDK亞基中是保守的。嵌合在AnfD中的FeFe輔因子的結構尚未確定，但光譜研究表明它與FeMo輔因子在結構上是同源的。以FeFe為前驅體合成了FeMo輔因子，然後採用一個Mo原子取代其中一個Fe原子的步驟。已有研究建議用FeFe前體作為鐵固氮酶中的FeFe輔因子。
與鉬固氮酶和釩固氮酶的研究相比，鐵固氮酶的研究相對滯後，直到最近才對該酶還原氮氣的機理進行了基本表徵。重要的是，這項研究表明，從棕色擬青黴中提純的鐵固氮酶甚至不含有微量的鉬或釩，正如一些人在過去的理論中所說的那樣。用氘（D）進行的光譜研究還表明，只有鐵的固氮酶在N2和D2下翻轉時生成HD，因此它具有與鉬固氮酶相同的還原消除機理。在鉬固氮酶中，四個電子和四個質子聚集在FeMo輔助因子上，形成一個含有兩個Fe-H-Fe鍵氫化物的狀態。這兩種氫化物結合在一起，在還原消除步驟中產生氫，該步驟與N2結合和還原相耦合（圖1c）。雖然還原消除機制很好地解釋了為什麼鉬固氮酶每還原一個N2就產生一個H2，但只有鐵固氮酶比鉬固氮酶生成的H2多得多，大約是每還原一個N2分子產生6-7個H2。這很可能反映了鐵固氮酶生成N2的Km值比鉬固氮酶要高出5倍，因此在一個大氣壓下，N2不足以超過通常在沒有N2的情況下被固氮酶催化的氫化物質子化反應，從而產生H2。類似的證據解釋了為什麼釩固氮酶比鐵固氮酶產生的H2量少，但比Mo酶多。
圖3. Rhodopseudomonas palustris中nif、vnf和anf三種固氮酶基因的組織結構。
鉬固氮酶的最小特定基因集，包括其結構基因、FeMo輔因子合成基因和酶組裝基因，被認為是nifH、nifD、nifK、nifB、nifE和nifN （圖3）。此外，nifU和nifS基因產物對於供應Fe-S簇很重要，nifV基因通常存在於一些微生物和編碼一種蛋白質，催化合成FeMo輔因子的核心成分同檸檬酸。然而，根據物種的不同，高檸檬酸鹽也可以來源於一般新陳代謝。nifB編碼一種自由基S-腺苷甲硫氨酸依賴酶，該酶在組裝FeMo和FeV輔因子的8Fe核心中起核心作用。與NifDK和VnfDK同源的NifeN和VnfeN為輔因子的最終成熟提供了支架，還有釩和鐵固氮酶特異性調控基因。最後，固氮酶需要還原鐵氧化還原蛋白或黃素的形式來提供一個低勢電子的來源來進行活性調節，有幾種類型的酶可以實現這一點，其中一些酶可能與nif基因協調調節。其中包括丙酮酸-黃麴黴毒素氧化還原酶、電子分叉的FixABCX系統和膜結合的RNF系統。
一般來說，vnfHDGK結構基因和vnfEN組裝基因在特定的微生物中被發現是共調控的，並且共調控基因通常也包括V運輸系統的基因。鐵固氮酶的結構基因作為anfHDGK在不同的基因組中聚集在一起，但沒有報導anfEN組裝基因的實例（圖3）。這項初步的研究表明，一些nif基因參與了VFe和FeFe輔因子的合成，有時還需要一些用於酶組裝的nif基因來產生功能性的替代固氮酶。已有研究巧妙地展示了合成鐵固氮酶所需的最小nif基因集。他們利用棕色假單胞菌的anf基因和催產克雷伯氏菌的nif基因，設計併合成了具有活性的鐵固氮酶。研究小組發現，除了anfHDGK外，nifUSVB基因也是合成功能性鐵固氮酶所必需的。有趣的是，在重組大腸桿菌系統中提供支架基因nifEN或vnfEN並不能提高鐵固氮酶的活性，這表明它們不是FeFe輔因子合成所必需的。有可能是anfDK扮演了這個角色。這些實驗清楚地表明合成鉬固氮酶所需的、受鉬固氮酶調控的基因也是鐵固氮酶合成所必需的，從而解釋了為什麼只有鐵的固氮酶只存在於也合成鉬固氮酶的微生物中。釩固氮酶的情況也是如此，據目前所知，釩固氮酶至少需要NifB。
鉬固氮酶的一個重要特徵是它能減少大量的底物，除了還原N2和質子。早期對提純的鉬固氮酶的研究表明，它在一個雙電子/雙質子反應中將氣體乙炔（HC≡CH）還原為乙烯（H2C = CH2）。由於N2還原為NH3的測定在技術上存在困難，特別是在體內，乙炔還原試驗已成為測定固氮的標準方法。除乙炔外，還有一長串含氮、硫和碳的小分子可以被鉬固氮酶還原，其中許多是非生理性質的。許多這類研究是體外用純化的固氮酶和在存在的其它金屬催化劑進行的。不同的固氮酶的底物分布幾乎沒有被徹底研究過。釩固氮酶提供的一氧化碳（CO）在體外產生C2和C3碳氫化合物。紫藤中表達的釩固氮酶也將CO還原並連接成碳氫化合物。鉬固氮酶，可能還有其它的固氮酶，能將二氧化碳（CO2）還原為甲酸。釩和鐵固氮酶能將CO2還原為CH4，而鐵固氮酶產生的CH4明顯更多。
由於固氮酶需要大量的ATP和高能電子來催化，細胞只有在絕對需要的時候才合成這些酶來提供可用的氮。因此，固氮酶的合成和活性在轉錄和翻譯後水平上受到固定氮源的全面抑制，尤其是NH3。固氮酶對氧也極其敏感，這可能解釋了為什麼許多固氮微生物是專性厭氧菌。然而並不是所有的固氮菌都是這樣，一些細菌根據種類的不同，控制著固氮酶的合成以響應氧。釩和鐵固氮酶的合成通常也受鉬有效性的控制。
研究過的釩或鐵固氮酶種類很少，僅包括文氏假單胞菌（A.vinelandii）和幾種紫色非硫細菌，如莢膜紅假單胞菌、紅色紅螺菌和沼澤紅螺菌，均為α變形菌。文氏假單胞菌之所以吸引人，是因為它是一種必須好氧的細菌，在氧氣中生長似乎與活性固氮酶的表達相反。事實證明，棕色擬青黴有幾種保護固氮酶不被氧氣滅活的機制。一種是呼吸保護，即通過多種末端氧化酶的高呼吸活性來保持固氮酶所在的細胞質處於缺氧狀態。關於這一機制到底有多重要還存在一些爭議，但它可能確實發揮了一些作用。第二種機制是構象關閉，一個小的[2Fe：2S]鐵氧還蛋白（也被稱為FeSII或Shethna蛋白）與NifHDK固氮酶複合體結合，迫使它進入不活躍但耐氧的狀態，以在高氧環境中存活。這種蛋白是否也能滅活其它釩和鐵固氮酶似乎還沒有得到測試。棕色擬青黴anf基因簇包含一個基因（avin_49040，也稱為anf3），它編碼一種黃烷細胞色素，可以作為耗氧氧化酶發揮作用，這表明它可能在保護鐵固氮酶免受氧的影響方面發揮特殊作用。
紫色非硫變形桿菌是一種兼性厭氧細菌，它們以異養細菌的形式好氧生長，而以光營養細菌的形式厭氧生長。在這種情況下，它們能從光能中產生ATP，並在固氮條件下生長良好。這表明，從理論上講，這類細菌不應該需要保護其固氮酶免受氧氣的傷害。然而，有報導稱紫色非硫細菌在微氧生長過程中發揮固氮作用。與此相一致的是，莢膜紅假單胞菌和沼澤紅假單胞菌都與Avin_49040同源，Avin_3A是由anf3編碼的一種黃色細胞色素，可能在耗氧中起作用。在沼澤立克次體中，該基因（rpa1432）在只表達鐵的固氮酶的細胞中高度表達，而在表達鉬固氮酶的細胞中幾乎檢測不到。而在莢膜紅假單胞菌中，anf3 （RCasp_Rcc012094）是唯一依賴鐵的固氮酶生長所必需的。沼澤紅假單胞菌和莢膜紅假單胞菌也都編碼Shethna蛋白II（FeSII）的同源物。該蛋白（RPA1928）在使用三種固氮酶中的任何一種生長的沼澤立克次體菌株中都有高水平表達。
在自生變形桿菌中，固氮酶基因的表達是由通常參與氮代謝的調控蛋白層次控制的。因此，像大腸桿菌這樣的非固氮菌調節氮代謝的開創性工作是理解固氮酶是如何調節的基礎。從對大腸桿菌的研究中我們知道，自由生活的變形菌通過2-氧代穀氨酸（2-OG）和穀氨酸之間的比率來感知其細胞內的氮狀態，這通常反映在被稱為PII蛋白的小三聚體信號蛋白的尿苷基化狀態上，該蛋白與其它蛋白結合以調節其活性。2-OG還可以直接與蛋白質結合以調節其活性。許多固氮變形菌有兩個或三個PII蛋白，通常稱為GlnB和GlnK或GlnB、GlnK1和GlnK2。當2-OG水平較高（氮不足的標誌）時，一種名為GlnD的雙功能尿苷酸轉移酶/尿嘧啶脫除酶將尿苷醯基（UMP）基團添加到PII蛋白中，當2-OG水平較低且細胞有足夠的固定氮時，它會從PII-UMP中去除尿苷醯基。由組氨酸激酶和反應調節子組成的NtrBC雙組分調控系統的活性由PIIb蛋白（通常為GlnB）控制，因此當細胞以NH3作為唯一氮源生長時，PIIi不會尿苷化，因此它與NtrB結合以抑制其自身磷酸化並激活其磷酸酶活性。然而，在固氮條件下，當細胞缺乏氮時，會形成PII-UMP，在這種形式下，PII不與NtrB結合，從而允許它磷酸化NTRC。NTRC-P然後激活與氮代謝有關的各種基因的表達，包括glnK1、glnK2/NH3轉運蛋白基因、穀氨醯胺合成酶基因或NifA（圖4）。NifA是一種增強子結合蛋白，是細菌固氮酶基因表達的主要調節因子。它有一個N-末端的GAF結構域，一個中央的AAA+結構域和一個C-末端的螺旋-轉角-螺旋結合域（圖5）。在被研究的細菌中，在固氮條件下生長的細胞中，NifA的表達僅高出大約三倍。在A.vinelandii中，nifA不受NtrBC控制，而是組成性表達，另一種同樣組成性表達的蛋白稱為NifL，通過與NifA蛋白結合來調節翻譯後的NifA蛋白。在氮過量的條件下，GlnK與NifLK複合體結合以使其失活。在高氧條件下，具有PAS結構域的nifL也會使NifA失活。因此，當滿足氮限制和低氧條件時，NifA是活性的。而在其它細菌中，如光R. rubrum和R. palustris中，當PII-UMP（GlnB）與其N-末端GAF結構域結合時，NifA被激活。事實上，R. palustris nifA的q-連接區的突變或小的缺失，稱為nifA∗突變，使NifA在構成上活躍，從而使細胞表達當在沒有氮氣的情況下，以NH3作為唯一氮源生長時產生固氮酶和H2。這些q-連接子突變可能使NifA得以展開，從而使其始終處於活躍狀態（圖5）。
圖4. Rhodopseudomonas palustris在氮飢餓反應中三種固氮酶的合成和活性調控模型
圖5. NifA蛋白的結構域示意圖。
與NifA同源的蛋白質稱為vnfA和anfA，控制著vnfHDGK和anfHDGK基因在已被研究的細菌中的表達，這些細菌都是變形菌。要表達vnfA和anfA，必須滿足氮飢餓的條件。但除此之外，還有鉬、釩和極端氮飢餓的調控。
重要的是，雖然通常認為這三種固氮酶同功酶的表達是相互排斥的，但事實並非如此。在R. palustris中，Mo和Fe固氮酶在低Mo條件下共同表達；而在R. palustris中，鉬固氮酶失活和V存在時，Fe和釩固氮酶共表達。
研究了鉬酸根離子（MoO42−）對R. capsulatus固氮酶合成的調節作用。轉錄因子MopA和MopB編碼於其固氮基因簇中，MopA和MopB是類似於大腸桿菌模式的轉錄抑制因子，在其C端有一個鉬酸鹽結合域，N端有一個螺旋-轉螺旋的DNA結合域。鉬的結合增強了MopA和MopB蛋白對含有DNA共有序列鉬box的靶啟動子的親和力。以這種方式被轉錄抑制的基因之一是anfA。許多其它固氮微生物編碼替代固氮酶，包括A.vinelandii，M.acetivorans和紫色非硫細菌Phaeospirillum fulvum、Rhodbacter Maris、Rhodommicrobium vannielii，所有在它們的vnfA啟動子（如果存在）和anfA基因或操縱子的啟動子區域保守鉬box。這表明，在這些物種中，鉬的有效性抑制了另一種固氮酶的表達，其方式類似於在R. capsulatus中看到的方式。在A.vinelandii的研究中，Mo直接顯示了對anfA和vnfA轉錄的抑制作用。
紫色非硫細菌 （R.palustris）和紅色紅假單胞菌（R.rubrum）對鉬的反應不調節anfA的轉錄，而是在鉬固氮酶不活躍的情況下合成活性鐵固氮酶，例如由於其結構基因的突變，而與生長介質中鉬的水平無關。沼澤藻中釩固氮酶的表達也是如此。此外，在沼澤紅麴黴中，anfA和vnfA基因之前沒有Mo盒，儘管Mo轉運子之前有鉬盒。沼澤羅非魚vnfA與NifA的同源性為70%，而其胺基酸序列的同源性僅為36%。當氮源為氮源時，anfA和vnfA基因分別上調約70倍和30倍，在鉬固氮酶不表達的情況下，anfA和vnfA基因分別上調約70倍和30倍。並且anfHDGK和vnfHDGK結構基因也上調。這表明當anfA和vnfA蛋白被表達時轉錄其目標基因是活躍的。與NifA的情況不同，它們不再需要採取主動構象來精通轉錄（圖4）。現有證據表明，在氮缺乏條件下anfA和vnfA的表達被激活，這種條件比激活NifA轉錄所需的條件更極端。其機制尚未確定，但根據已知的一般氮代謝情況，可能與2OG水平升高或超尿酸化PII化蛋白有關。一些轉錄實驗表明，NifA能激活沼澤紅假單胞菌中anfA和vnfA的表達，但還必須有其它要求，因為表達活性NifA∗蛋白的菌株不表達替代固氮酶。
當生長介質中的NH3或能量突然下降時，某些變形菌會立即關閉鉬固氮酶的活性。其機制是一個保守的精氨酸在NifH（二氮酶還原酶）上進行翻譯後ADP-核糖基化。這阻止了NifH與NifDK的相互作用，從而抑制了電子轉移和固氮酶活性。這種修飾是可逆的，由固氮酶還原酶、ADP-核糖基轉移酶（DraT）和固氮酶還原酶激活糖水解酶（DraG）催化。在包括R. capsulatus在內的紫色非硫細菌中已發現AnfH的ADP-核糖基化和R.Parustris的VnfH的ADP-核糖基化也存在於R. palustris中。
AnfH與NifH的差異比VnfH大得多，胺基酸同源性約為45%。但R. palustris的NifH、VnfH和AnfH至少在同一相對位置都有保守的精氨酸，這是ADP-核糖基化的位點。R. palustris anf基因簇包括一個draT1基因（rpa1431），該基因與anfHDGK基因協同調控。還有一個draT2基因是結構性表達的，它介導鉬固氮酶活性的關閉，並與染色體上的draG2基因配對。在所有研究的案例中，固氮酶翻譯後修飾的Drag-DRAT系統都是由PII蛋白控制的（圖4）。
由於缺乏關於替代固氮酶在自然界中固氮作用的信息，阻礙了對生物氮循環的全面認識。大量的間接證據表明，只有V和Fe的固氮酶可能是有活性的。鉬是地殼中最稀缺的微量元素，在實驗室培養的鉬限制條件下，編碼替代固氮酶的細菌似乎總能表達功能酶。此外，替代固氮酶基因在藍藻細菌地衣共生體、白蟻后腸和用V改良的土壤微生態中也有表達。
直接評估替代固氮酶活性的一個問題是，直到最近還沒有一種簡單的方法來測量和區分環境樣品中鉬和替代固氮酶的活性。同位素乙炔還原法（ISARA）是一種有價值的新方法，它是通過觀察三種固氮酶對15N/14N天然豐度進行不同程度的分割，替代固氮酶與鉬固氮酶相比，顯著降低了15N/14N的比值。事實證明，Mo和選擇固氮酶在乙炔還原試驗中對乙炔的13C/12C豐度的分級也不同。這可以通過氣相色譜-燃燒-同位素比值質譜法檢測13C乙烯的同位素豐度來測定。13C乙烯是由氮化酶還原乙炔的產物。替代固氮酶的另一個診斷特徵是，作為乙炔還原的產物，它們催化乙烷和乙烯的生成，鐵固氮酶比釩固氮酶產生更多的乙烷。另一方面，鉬固氮酶將乙炔完全還原為乙烯。
在實踐中，需要有相當高的固氮酶活性才能檢測乙烷或使用ISARA，這可能會限制廣泛的環境調查。然而在某些環境中，這些檢測提供了替代固氮酶活性的證據。在一項研究中，ISARA對大沼澤地國家公園的落葉樣本和大西佩維塞特沼澤的沉積物樣本的測量表明，存在活躍的替代固氮酶，這些樣本還含有anfD和vnfD基因。這些測量很可能包括了沉積物樣品中所有三種固氮酶活性的貢獻，因此只能得出結論，單靠鉬固氮酶不能解釋所獲得的乙炔碳同位素分餾值，而且一定有一部分固氮酶是由鐵和釩固氮酶貢獻的。因此只能得出這樣的結論：僅有鉬固氮酶不能解釋所獲得的乙炔碳同位素分餾值，而一定有一部分固氮酶是由鐵和釩固氮酶貢獻的。該研究估計，在葉凋落物和沼澤沉積物中測得的乙炔減少量中，分別有24%和18%是由於替代固氮酶活性所致。
第二項更廣泛的研究考察了釩固氮酶對北方森林藍藻生物固氮的貢獻。北極圈森林佔據著亞北極，主要是樺樹、楊樹和針葉樹等植物，這些植物並不是已知的固氮共生體的宿主。這些森林和它們的土壤儲存了大量的碳，固定氮的可用性被認為是一個可能限制它們吸收未來人為增加的大氣二氧化碳的能力的因素。此外，據報導，藍藻為亞北極白樺林貢獻了85%以上的固定氮。在這裡，藍藻是真菌和藍細菌（通常是念珠藻屬）之間的共生組合，念珠藻屬是一種已知能表達活性鉬和釩固氮酶的屬。在加拿大東部一條縱向橫斷面上的北方藍藻樣本中，有一半的樣本具有替代固氮酶活性。由於藍藻編碼V而不是鐵固氮酶，因此作者得出結論，所有測得的活性都歸因於V替代固氮酶。並且我們測定了地衣營養部分（葉狀體）的鉬含量，發現鉬含量與釩固氮酶的平均活性呈負相關。這些結果表明，高達50%的總固氮可能是由於V而不是鉬固氮酶的活性。人們預計還將開展其它研究，以評估替代固氮酶對全球固氮的貢獻。
固氮的極端能量要求反映在哈伯-博世工業過程中將N2轉化為NH3作為肥料的要求。這一過程需要200個大氣壓和400°C的壓力，才能使用鐵催化劑將N2+H2轉化為NH3。這一反應是由生活在1個大氣壓和30°C的微生物完成的，這是值得注意的。同時，由於固氮酶的複雜性，除固氮外，固氮酶還發生催化反應，最主要的是產氫。在NAD或NAD等電子載體的氧化過程中，H2的產生起著重要的作用。在新陳代謝過程中，尤其是在厭氧代謝過程中減少的鐵氧還蛋白。例如，紫色非硫細菌不會生長在比細胞生物量更低的碳化合物（如丁醇）上，除非它們是在固氮條件下生長的，以允許產生氫氣作為緩解過量還原當量的一種方式。許多發酵細菌如果被允許使用質子作為電子受體來產生氫氣，就可以產生更多的ATP。這會增加細胞用來固定氮的三磷酸腺苷（ATP）的量。另一種可能有用的產物是CH4，它是R. palustris、R. rubrum、R. capsulatus和 A. vinelandii的細胞在固氮條件下用鐵固氮酶培養時產生的。這一環節產生的甲烷數量很少，但足以支持專性利用甲烷的甲基單胞菌菌株在共培養中的生長 （圖6）。
替代固氮酶在細菌和古細菌中的廣泛存在，以及越來越多的證據表明它們在自然界中的高表達和活性支持了替代固氮酶是安全酶並可以替代鉬固氮酶支持全球生物固氮的觀點。故障保護一詞不應被理解為不重要。人們越來越認識到，在某些生態系統中，釩和鐵固氮酶可能在固氮中發揮重要作用。此外，這些替代固氮酶可能在支持微生物和微生物群落方面發揮輔助作用，這些微生物和微生物群落依賴於H2作為氧化還原釋放機制，而CH4作為碳源。
1. 固氮酶有三種形式：鉬固氮酶、釩固氮酶和鐵固氮酶。
2. 鉬固氮酶最先出現，是三種酶中將N2轉化為NH3效率最高的酶。
3. 僅含釩和鐵的替代固氮酶被認為是細菌和古菌在鉬限制時使用的後備酶。
4. 僅含釩和鐵的固氮酶在其活性部位含有VFe和FeFe輔助因子，而不是鉬鐵輔助因子。
5. 這兩種交替固氮酶只存在於也含有鉬固氮酶的微生物中。
6. 釩和鐵固氮酶在環境中具有活性，釩固氮酶可能對亞北極陸地地區的全球生物固氮起作用。
7. 鐵固氮酶產生大量的甲烷，這可能支持自然界中微生物群落的生長。
8. 三種固氮酶都能產生相當數量的氫氣。
展望
1. 產甲烷古菌和鞭毛蟲，尤其是梭狀芽胞桿菌中的釩和鐵固氮酶的生理和調控幾乎一無所知。
2. 對替代固氮酶表達調控的分子機制知之甚少，尤其是在不通過鉬酸鹽抑制來調控基因表達的細菌中更是如此。
3. 可被替代固氮酶還原的小分子的全部範圍尚不清楚。
4. 與釩和鐵固氮酶結構基因協同調控的基因有5~20個，但它們的功能大多未知。
5. 僅含V和Fe的固氮酶對全球氮循環的貢獻尚未得到系統的研究。
6. 只表達鐵固氮酶的微生物可能通過產生CH4和NH3來影響微生物群落的相互作用，但這一點還有待探索。
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