重大突破:電子顯微鏡拍出細胞彩照!

2020-12-17 生物谷

想像一下，假如世界失去了色彩，只剩下黑白灰的組合，我們眼前的風景會變成什麼樣？在電子顯微鏡下，我們所能看到的就是這樣一個世界。電子顯微鏡能幫助我們觀察微小的病毒、細胞超微結構，但它只能得到黑白的灰度圖片。

而在最近，加利福尼亞大學聖地牙哥分校的研究者們研發了一種新技術，使得「用電鏡拍彩照」成為了可能。他們用特殊染料標記樣品，得到了多色的電鏡成像，這是怎麼做到的呢？

圖片來自：S. R. Adams et al

沒有色彩的電鏡世界

在過去，光學顯微鏡帶領著人們第一次走進了肉眼不可辨別的微觀世界，微生物和各種生命體內的微觀結構開始為人所知。不過，當人們需要觀察更加微小的結構時，光學顯微鏡的放大倍數就顯得不夠用了：受到衍射的影響，光學顯微鏡的分辨極限大約在200 nm，在此基礎上即使再去放大，也無法看到清晰的成像了。為進一步提高解析度，科學家們就用波長短得多的電子束替代了可見光，製造出了電子顯微鏡。電子顯微鏡使微觀成像的分辨達到了 0.1 nm，這項重要的技術的研發者1986年獲得了諾貝爾物理學獎。

然而，電子顯微鏡也有自己的缺點：這是一個沒有色彩的黑白世界。可見光有不同色彩，我們也可以很方便地給生物組織的特定成分加上染色或是螢光標記。而電鏡獲得的圖像是反映電子多少（即亮度）的「灰度圖」，其中沒有色彩信息。當然，人們可以給電鏡圖片進行後期上色，但這樣的上色並不能選擇性地突出所要觀察的結構。如果原圖中的灰度差別不大，後期上色也會很難將它們分開。

這張色彩夢幻的噬菌體圖片來自透射電子顯微鏡，它的顏色就是「偽彩色」。圖片來自：Sterling Publishing

為了讓電鏡圖片更加「突出重點」，科學家們已經做出了很多努力，例如加入重金屬來提高「對比度」。生物主要是由碳氫氧氮這樣比較輕的元素構成，電子透過得到的圖像對比度較低（就像是一幅淡淡的鉛筆畫）。而如果用重金屬（如鋨、鈾或者鉛）把背景染成深色，或是讓它們與脂質或蛋白質進行結合，就可以得到更加黑白分明的圖像。但是，這樣做依然無法重點區分特定的生物分子。還有科學家嘗試將這些重金屬顆粒與抗體結合，讓它們結合到特定的生物分子上去，但這種「標籤」難以進入細胞，因此適用範圍還是有限。

負染法示意圖。圖片來自：quazoo.com

為黑白圖像染上「顏色」

而這一次，研究者們帶來了一些為電鏡圖片「染色」的新思路。他們給染料分子連上了不同的鑭系金屬元素，並讓這些染料沉澱到特異性標記的周圍。雖然電子顯微鏡下依然沒有真正意義上的色彩，但通過投射電子的能量損失不同，這些染料可以產生彼此區分的信號。這樣一來，就相當於給樣品加上了不同的色彩標籤。

研究者們將顯色劑二氨基聯苯與鑭系金屬耦合在一起，作為電子顯微鏡的「特製染料」。想要標記生物分子時，就給對應的抗體連上螢光集團或是氧化酶分子，再通過光或者酶來誘發反應，讓染料沉積到目標周圍。在完成「染色」之後，再按照常規的氧化鋨負染以增強對比度，進行電鏡成像。

Ln-DAB2染料和染色方法：用帶有氧化分子（紅色為螢光分子，綠色為辣根過氧化酶）的抗體特異性標記目標分子（圖中為紅色標記線粒體和綠色標記核膜），分別讓不同的Ln-DAB2染料在抗體附近原位氧化沉澱。再經過常規樣品處理並分別成像，使用計算機處理得到彩色圖像。

在成像時，研究者用一束動能一致的電子投射到樣品上。當電子通過樣品時，會與其中的原子發生碰撞，進而損失一部分能量，在用不同染料處理過的地方，電子的能量損失會產生明顯的差異。通過檢測這些差異，就可以讓染色位置從背景中脫穎而出了。通過計算機處理，將不同染料對應的信號分別轉換成不同的偽彩色，再與原始的黑白電鏡圖片疊加，這樣就得到了我們在開頭處看到的電鏡彩照。

彩色電鏡分別成像：A為傳統電鏡圖；C和D分別為標記的線粒體和細胞膜；E是偽彩疊加圖

鬧了半天，顏色還是「假的」？的確，區分了能量差異，電子束依然沒有真正的顏色。不過，與「純靠想像」的後期上色相比，染料的標記還是起了很大作用。論文作者證明，這種方法可以分別用於細胞和組織的染色，並足以將不同的分子標記從傳統的黑白電鏡成像中分離出來。

彩色電鏡的應用：星形膠質細胞分享突觸結構圖（F）；細胞透膜肽介導的內吞囊泡圖（H）；新合成PKM 在神經元中的定位圖（D）

目前，這種方法還只能在拍出三種「色彩」：它們分別被標記為紅色、綠色和黃色。研究者希望，將來還能加入更多顏色種類，進一步提高圖像的對比度。

在過去二十年中，超高分辨螢光顯微成像技術正突破著光學顯微鏡的成像極限，而現在，電子顯微鏡的世界也變得多彩了起來。這些技術的進步都將帶領科學家們更深入地了解細胞內部的精細構造，揭開更多微觀世界的生命奧秘。(生物谷Bioon.com)

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