【分析】EDC催化的羧基醯胺化反應的副反應分析

2021-02-19 X-MOL資訊

醯胺化反應是發生在羧基上的衍生化反應。在蛋白質化學中，常用的醯胺化反應是由EDC和NHS催化，主要是由於EDC在水介質中具有高溶解度和高催化效率。目前，EDC催化的醯胺化反應已被廣泛用於多個方面的研究中，包括蛋白質C-末端組學、蛋白質糖基化以及蛋白質化學交聯分析等。近期，復旦大學張旭敏教授課題組報導了羧基醯胺化反應過程中發生在酪氨酸上的特異副反應，相關論文發表在國際權威化學雜誌Analytical Chemistry 上。在該研究中，作者首先分析了之前發表的利用EDC羧基醯胺化反應的數據，發現含酪氨酸的肽段極難被鑑定到，因此推測含酪氨酸的肽段可能發生了一些未知反應。為了探究酪氨酸上可能的反應形式，作者利用Open Search搜索策略，並且使用已知序列的合成肽段進行探究，確定了該酪氨酸特異的副反應表現為「+155 Da」的修飾。通過對分子量的進一步驗證，最終確定了+ 155 Da的修飾是由於酪氨酸側鏈上添加了一個EDC基團。作者推測的副產物形成的分子機理如下圖所示：酪氨酸的酚羥基可以與EDC反應形成類似O-醯基脲的中間體，並且由於與相鄰苯基的共軛作用使其穩定性而大大提高，表現為+ 155 Da的副反應。

圖1. 推測的 155 Da 副反應產物形成的分子機理。圖片來源：Anal. Chem.為了降低副反應的影響，作者給出了建議：（1）在搜庫過程中將酪氨酸上的 EDC 修飾設為可變修飾，並且將 155 Da 設為中性丟失，可以顯著提高含酪氨酸肽段的鑑定；（2）用含碳酸氫鹽的緩衝液（如TEAB緩衝液）對 EDC 羧基保護的產物進行過夜孵育處理，可以顯著減少副產物。如圖2所示，使用TEAB緩衝液，過夜酶切及額外的12小時孵育，酪氨酸副反應的比例降低為1.3%。

圖2. 碳酸氫鹽緩衝液可以顯著地降低酪氨酸副反應。圖片來源：Anal. Chem.基於EDC的羧基醯胺化反應是應用最為廣泛的羧基反應之一。本研究提示在今後使用EDC羧基反應的實驗中，應全面考慮到該副反應的可能影響。此外，亦可參考本研究的方法對副反應進行去除。最後，作者提出利用先進的質譜技術和生物信息學手段，對目前應用的其它蛋白質化學方法進行系統分析評價十分有必要。這一成果近期發表在Analytical Chemistry 上，文章的第一作者是復旦大學大學博士研究生李青青和碩士研究生張陽。Tyrosine–EDC Conjugation, an Undesirable Side Effect of the EDC-Catalyzed Carboxyl Labeling ApproachQingqing Li, Yang Zhang, Zhen Wu, Jingnan Huang, Ningning Yue, Lin Huang, Xumin Zhang*Anal. Chem., 2020, DOI: 10.1021/acs.analchem.0c03487


張旭敏，復旦大學生命科學學院研究員。1998年獲北京師範大學生物化學學士學位，2001年獲北京師範大學生物化學碩士學位。2001－2004年北京華大基因研究中心工作。2004-2008在丹麥南丹麥大學獲蛋白質組學和生物質譜學博士學位。2008-2010在丹麥南丹麥大學從事博士後工作，2010-2012年在丹麥奧胡斯大學從事博士後工作。2013年起就職於復旦大學。研究方向包括：1）基於生物質譜學的蛋白質組學和代謝組學相關的方法學研；2）利用模式生物秀麗隱杆線蟲研究環境因素對衰老的影響。在相關領域發表SCI論文40餘篇，包括多篇以通訊作者發表的Anal Chem，J Proteome Res，Proteomics等。https://www.x-mol.com/university/faculty/240883Q：這項研究最初是什麼目的？或者說想法是怎麼產生的？A：我們實驗室一致致力於蛋白質C末端分析方法的開發，包括優化了C-TAILS，應用多酶切策略提高C末端鑑定以及最近發表的BaSCX方法。我們發現蛋白質C末端的鑑定一直落後於與其相對的蛋白質N末端，我們認為除了蛋白質C末端肽段自身性質導致的難以被鑑定外，是不是還有什麼其他因素？因此，我們回顧了以前發表的 C-TAILS 方法的相關數據，發現了含酪氨酸的肽段很難被鑑定到，並對此進行了系統探究。A：研究過程中遇到的挑戰是在我們確定了「+155 Da」的副反應是由於在酪氨酸上加上了一個EDC分子後，我們希望能夠從根本上去除這一副反應。因此，我們嘗試了多種可能的緩衝液體系，並最終發現含有碳酸氫鹽的緩衝液去除效果最好。Q：該研究成果可能有哪些重要的應用？哪些領域的企業或研究機構可能從該成果中獲得幫助？A：蛋白質化學方法通常針對以下三個反應活性基團:硫醇(-SH)、胺基(-NH2)和羧基(-COOH)。酯化和醯胺化是蛋白質化學中兩個主要的以羧基為靶向的反應。由於酯化反應的產物不穩定且易於水解，所以目前很少使用酯化方法來對蛋白質羧基進行衍生化反應。在羧基醯胺化方面，經常選擇的是由 EDC 和 NHS 催化的羧基醯胺化方法。這是由於 EDC 在水介質中具有高溶解度和高催化效率。目前， EDC 催化的醯胺化已被廣泛用於各種研究中，包括蛋白質 C 末端組學，蛋白質糖基化以及蛋白質交聯等方面的研究。我們的研究結果提示所有應用 EDC 催化的醯胺化反應的研究人員，在進行實驗前要考慮到可能發生在酪氨酸的副反應對結果的幹擾，同時也可參考我們的方法去除酪氨酸副反應。我們的結果提示即使對目前廣泛使用的蛋白質化學方法，其特異性，副反應也沒有得到充分證實，應該應用先進的質譜技術和生物信息學手段，對相應的技術方法進行深度分析評價是十分有必要的。

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