清華大學生命科學學院隋森芳教授研究組在《科學●進展》(Science Advances)期刊上在線發表題為"SNARE複合體解聚的機制研究"(Mechanistic insights into the SNARE complex disassembly)的研究論文,通過解析SNARE解聚分子機器20S複合體的高解析度冷凍電鏡三維結構,並結合生化實驗、電生理實驗和交聯質譜實驗,揭示了SNARE複合體的解聚機制。
膜融合是生命基本和重要的過程之一,真核細胞多種形式的胞內區間具有不同的生物化學性質,細胞維持這些胞內分區之間的動態平衡主要依賴的是囊泡轉運,該過程與許多重要疾病密切相關。囊泡轉運即包含轉運物質的囊泡從供體出芽然後轉移至目標膜,錨定之後與目標膜融合,從而使得膜蛋白、磷脂和內容物轉運至另一個細胞區間。神經遞質的釋放就是通過突觸囊泡與質膜的融合實現的。位於囊泡膜上的v-SNARE蛋白和位於目標膜上的t-SNARE蛋白在形成SNARE複合體的過程中將兩膜拉近並驅動膜融合的發生。SNARE複合體是非常穩定的四螺旋束結構,必須被解聚成單體以便循環使用,在細胞內這是通過馬達蛋白NSF及其接頭蛋白SNAP共同完成的。NSF蛋白是一種多細胞功能相關的ATP酶(AAA+ ATPase),它與接頭蛋白SNAP、SNARE複合體一起形成沉降係數為20S的複合體。在20S複合體中,NSF在SNAP的幫助下利用水解ATP產生的能量將SNARE複合體解開成單體,使胞內膜融合的過程得以循環進行。20S複合體是一個非常高效的分子機器,對其工作機制的研究不僅有助於深入理解胞內SNARE的循環利用機制及膜融合的調控機制,也對揭示AAA+ ATPase酶的分子機理具有重要的意義,因此一直是科學家們研究的熱點問題。
隋森芳教授研究組長期致力於利用冷凍電鏡技術研究與生物膜相關的重要蛋白複合體的結構與功能。此前,曾於2012年在《自然結構與分子生物學》(Nature Structural & Molecular Biology)期刊上報導了全長NSF蛋白在水解ATP過程中各個狀態的三維結構以及20S複合體的負染電鏡三維結構。隨後,又於2015年在《細胞研究》(Cell Research)期刊上報導了20S複合體的低解析度冷凍電鏡三維結構和SNAP-SNARE亞組裝體中等解析度的結構,發現並驗證了新的解聚關鍵胺基酸。在此次發表的《科學●進展》論文中,研究人員通過優化冷凍樣品製備條件將錨定在
納米盤(Nanodisc,模擬細胞膜的脂質雙分子層)上的20S複合體的解析度推進至4.6 ai.png,並進一步通過分割重構法將NSF六聚體和α-SNAP-SNARE亞組裝體的解析度提高到3.9 ai.png和3.7 ai.png(圖1)。
這些高解析度結構揭示了20S複合物中蛋白質相互作用的許多細節。結合生化分析,研究者發現在SNARE解聚過程中,α-SNAPs主要通過R116殘基的靜電作用和L197殘基的疏水作用對VAMP單鏈的兩個位點施加作用力。為了進一步評價R116和L197在體內的功能相關性,研究者與清華大學生命學院姚駿老師課題組合作檢測了這些突變體對培養的海馬神經元釋放神經遞質的影響。結果表明,與野生型α-SNAP過表達相比,R116A和L197A顯著降低了突觸小泡的釋放速度,表明這兩個突變體可能通過降低SNARE複合物的解聚能力而顯著削弱了膜融合(圖2)。
此外結合交聯質譜實驗,研究者證明了SNARE螺旋束的氨基末端與NSF-D1結構域的中心孔環之間有直接相互作用,並驗證了這種相互作用可能作為錨定支點在SNARE複合體的解聚中發揮重要作用。該研究提供了一個詳細的α-SNAP介導的SNARE複合體解聚的旋轉模型(圖3):NSF利用ATP水解產生的能量帶動α-SNAP圓筒沿右手方向旋轉從而對SNARE複合體的左手方向螺旋束施加解旋方向的切線力——主要來自於α-SNAP蛋白的 R116殘基與VAMP蛋白的E62和D68殘基的靜電作用以及α-SNAP蛋白的L197殘基與VAMP蛋白的V48、V50和L54殘基的疏水作用。同時由於SNARE複合物的N端直接錨定在NSF-D1的孔區,右手扭矩將開始展開和/或破壞左手螺旋的SNARE複合物,從而同時或連續地將複合物分解成單個蛋白質。 (
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