摘 要：目的 探究微波炮附子炮製過程的主要工藝影響因素，為工業化開發奠定基礎。方法 通過水分比、乾燥速率及耗能研究微波炮附子的乾燥過程，並以微波炮附子形態以及雙酯型生物鹼、單酯型生物鹼、醇胺型生物鹼含量為指標，考察生附片切片厚度、含水量、微波功率、炮製時間對微波炮附子工藝的影響。結果 生附片厚度、復水率、微波功率、炮製時間對微波炮附子炮製過程及生物鹼含量均有影響。厚度為5 mm，乾燥時間短，乾燥速率快，耗能小，但是雙酯型生物鹼含量高，總生物鹼含量損失較大。生附片復水率為60%時，乾燥時間最短，平均乾燥速率為復水率100%＞復水率60%＞復水率80%＞復水率40%；雙酯型生物鹼含量為復水率60%＞復水率100%＞復水率80%＞復水率40%；總生物鹼含量為復水率 60%＞復水率80%≈復水率100%＞復水率40%；復水率對耗能影響不明顯。炮製時間相同時，在微波功率為550 W條件下，微波炮附子乾燥時間最短，乾燥速率快，雙酯型烏頭鹼含量低，總生物鹼含量高，但是隨著炮製時間的增加，高功率條件下的附子更容易被炮焦。結論 適宜的附片厚度、復水率、微波功率以及炮製時間有助於附子充分減毒，提升微波炮附子產品質量。生附片切片厚度宜選擇3 mm，復水率為60%～80%，炮製時間根據微波功率增加，適當減小。
炮附子是《傷寒論》中的特色飲片，溫脾腎、補命火，主治腎陽不足、寒溼內盛諸證，為補命門真火之要藥[1]。然而，《傷寒論》中僅有「附子一枚，炮，去皮，破八片」的簡單記載，如何「炮」，語焉不詳，唐宋以後炮附子幾乎失傳。20世紀80年代後期，楊明教授在復原炮附子過程中發現，傳統炮法存在火源不穩、火候火力時間難控、飲片質量不佳等問題[1]。經過炮製設備與工藝的反覆試驗，創新性地採用當時極為稀少的微波作為熱源，以膽附子為原料，通過退膽、雙氧水去皮、蒸製10 min、晾乾，並埋入油砂中，微波照射15 min，成功製備了符合炮天雄質量要求的新型微波炮附子，拓展深化了傳統「炮」法的技術內涵[1]。
近年來，附子浸膽環節的弊端逐漸顯現，超過70%以上的生物鹼成分流失，炮製環節的水制（浸、漂）與水火共制（蒸、煮），使得強心成分去甲烏藥鹼、去甲豬毛菜鹼等水溶性生物鹼大量流失，療效大打折扣[2-3]。如何縮短附子炮製工藝流程，尤其是減少水處理環節成為附子存效的關鍵[4]。微波炮製具有獨特的熱力學形態，溫度高、升溫快、時間短，兼有滅菌作用，成為現代火製法的重要發展[5-8]。鑑於微波設備與藥材要求均已發生顯著變化，30多年前的微波炮製研究工藝已難以指導當今微波炮附子的生產。
因此，基於質量源於設計（quality by design，QbD）理念[9-10]，本實驗以生附片為原料，以實現微波炮製過程中附子澱粉組織的膨化與生物鹼受熱水解減毒同步完成為目標，以炮附子形態與毒性成分的降解殘留為評價指標，對影響微波炮附子的主要工藝因素進行研究，以期為微波炮附子的工業化開發與精細製造奠定基礎。
1 儀器與試藥
Agilent1260高效液相色譜儀，美國Agilent公司，配有在線脫氣機，四元泵，自動進樣器；Agilent6460C三重串聯四極杆液質聯用儀，美國Agilent公司，配有ESI離子源；BP211DAG電子分析天平，德國Sartorius司；KQ-300DA型數控超聲波清洗器，中國崑山市超聲儀器有限公司；1-L213B快捷微波爐，美的集團股份有限公司；HT-19紅外成像儀，東莞市鑫泰儀器儀表有限公司。
金龍魚食用植物調和油購於豐益貿易（中國）有限公司；乙腈、甲醇為色譜純，購於美國Thermo Fisher Scientific公司；甲酸為色譜純，購於成都市科龍化工試劑廠；水為屈臣氏蒸餾水，購於廣州屈臣氏食品飲料有限公司；其餘試劑均為分析純。對照品新烏頭鹼（批號CHB180311）、烏頭鹼（批號CHB80408）、次烏頭鹼（批號CHB180524）、苯甲醯新烏頭原鹼（批號CHB180310）、苯甲醯烏頭原鹼（批號CHB180309）、苯甲醯次烏頭原鹼（批號CHB180307）購於成都克洛瑪生物科技有限公司；對照品烏頭原鹼（批號MUST-16060306）購於成都曼斯特生物科技有限公司；所有對照品質量分數均≥98%。生附片於2019年購自四川攀西佳能達藥業有限公司，經成都中醫藥大學藥學院張定堃副教授鑑定為毛莨科植物烏頭Aconitum carmichaelii Debx. 的子根加工品。
2 方法
2.1 生附片的選擇
選取直徑為1.5～2.0 cm的生附片作為微波炮附子的加工原料。
2.2 油砂的製備
將粗細一致（過2號篩）、乾淨的河砂倒入鍋中，翻炒加熱後，倒入食用油（油-砂為3∶100），翻炒至油煙散盡，河砂黑亮為宜。
2.3 微波炮附子製備方法
取50 g生附片，平鋪於方盤中，加入一定量蒸餾水，放置12 h，待其自然復水，埋入油砂中（生附片-油砂質量比為2∶100），放入微波爐，在550 W功率下加熱3 min，放冷至室溫，取出，篩去油砂，即得。
2.4 失水過程的測定
取50 g生附片，稱定質量，復水後，埋入油砂中，再次稱定質量，並按照預設功率進行炮製，每隔1 min取出樣品稱定質量。直至樣品水分含量小於2%為止，稱質量過程在20 s內完成。
2.5 生附片厚度對微波炮附子的影響
分別取3批3、5 mm厚的生附片（50 g），復水後，埋入油砂中，並按照「2.3」項下預設功率進行炮製，備用。另外，按照「2.4」項，進行微波炮附子失水過程的測定。
2.6 復水率對微波炮附子的影響
取等量（50 g）的生附片，分別吸收40%、60%、80%、100%的蒸餾水，放入微波爐中，按照「2.3」進行製備，分別製備3批，備用。另外，按照「2.4」項，進行微波炮附子失水過程的測定。
2.7 微波功率與時間對微波炮附子的影響
取3 mm厚生附片（50 g），復水後，埋入油砂，放入微波爐中分別使用400、550 W功率加熱1、2、3、4 min，放冷至室溫，取出，分別製備3批備用，且製備過程中採用紅外成像儀監測炮製溫度。另外，按照「2.4」項，進行微波炮附子失水過程的測定。
2.8 乾燥參數的計算
2.8.1 水分比（moisture ratio，MR）與乾燥速率（drying rate，DR） MR用於表示一定乾燥條件下物料中剩餘水分率[11-12]。整個乾燥過程，微波炮附子MR通過公式（1）計算。
MR＝(Mt－Me)/(M0－Me) （1）
M0為微波炮附子初始幹基含水量，Mt為微波炮附子在t時刻的幹基含水量，Me為微波炮附子平衡幹基含水量
由於微波炮製強度較大，假設微波炮附子在炮製終點時，平衡幹基含水量為0[13]，實驗過程中不同時刻微波炮附子的MR可簡化為公式（2）。
MR＝Mt/M0 （2）
DR由公式（3）求得。
DR＝(Mt＋Δt－Mt)/t （3）
Mt+Δt為微波炮附子在t＋Δt時刻的幹基含水量，t為乾燥時間
2.8.2 微波乾燥效能 微波乾燥時，不同切片厚度、含水量及微波功率對於微波乾燥效能的影響可通過單位能耗（ES）表示。ES可由公式（4）進行計算，即蒸發單位量水分所消耗的能量。
ES＝Pt′/(106 mw) （4）
ES為單位能耗（kJ/g），即從物料中蒸發1 g水的能耗，mw為蒸發的水蒸氣質量，P為射頻輸出功率，t′為間隔時間
2.9 色譜及質譜條件
2.9.1 色譜條件 菲羅門Gemini C18色譜柱（150 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相為0.1%甲酸水溶液-乙腈，梯度洗脫，0～1 min，2%～20%乙腈；1～5 min，20%～50%乙腈；5～10min，50%～75%乙腈；10～15 min，75%～100%乙腈；體積流量為0.45mL/min；柱溫25 ℃；進樣量5 μL。
2.9.2 質譜條件 採用ESI源，正離子模式檢測；脫溶劑溫度300 ℃；脫溶劑氣N2體積流量11 L/min；霧化器壓力15 psi（1 psi＝6.895 kPa）；毛細管電壓4 000 V；掃描方式為MRM檢測；7個化合物測定的離子對、碎裂電壓和碰撞能量見表1。
2.9.3 對照品溶液的配製 分別取各對照品適量，精密稱定，用甲醇配製成含147 μg/mL烏頭鹼、121 μg/mL新烏頭鹼、248 μg/mL次烏頭鹼、97 μg/mL苯甲醯烏頭原鹼、156 μg/mL苯甲醯新烏頭原鹼、107 μg/mL苯甲醯次烏頭原鹼、112 μg/mL烏頭原鹼的對照品溶液。
2.9.4 供試品溶液的製備 取微波炮附子粉末（過三號篩）0.2 g，精密稱定，置10 mL量瓶中，甲醇溶解定容至刻度，稱定質量，超聲提取30 min，取出，放冷，精密稱定，補足減失的質量，過0.22 μm微孔濾膜，即得供試品溶液[14]。
2.9.5 方法學驗證 取對照品儲備液適量，甲醇稀釋為不同質量濃度梯度的對照品溶液，在擬定的HPLC-MS/MS條件下測定。以待測物的質量濃度為橫坐標（X），待測物的峰面積為縱坐標（Y），繪製標準曲線，計算回歸方程及相關係數；同時測定各待測物的定量限（LOD，S/N＝10）和檢測限（LOQ，S/N＝3），結果見表2。其餘方法學已在前期研究中進行詳細考察[15]。
3 結果
3.1 生附片厚度對微波炮附子乾燥膨化過程與減毒效果的影響
乾燥膨化過程研究結果見圖1，7個生物鹼的含量測定結果見表3。由圖1可知，隨著乾燥時間的增加，微波炮附子MR呈現降低趨勢，且厚度越大，達到平衡水所需時間越短。其中切片厚度分別為3 、5 mm時，乾燥時間分別為8、11 min（圖1-A）。微波炮附子的DR隨著MR的增加呈現先上升後下降趨勢，且切片厚度為5 mm時的DR上升速率趨勢大於3 mm（圖1-B）。比較不同切片厚度對於ES的影響，發現切片厚度為3 mm和5 mm平均ES分別為1.08 kJ/g和0.68 kJ/g，且微波炮製過程中ES增加主要集中在MR較大或較小時（圖1-C）。比較切片厚度對微波炮附子性狀的影響，生附片越厚，微波炮製過程中越容易炮焦。
由表3可知，5 mm厚度生附片中雙酯型生物鹼（烏頭鹼、新烏頭鹼、次烏頭鹼）及醇胺型生物鹼（烏頭原鹼）含量高於3 mm厚度生附片，說明厚度對減毒效果有影響；而單酯型生物鹼（苯甲醯烏頭原鹼、苯甲醯新烏頭原鹼、苯甲醯次烏頭原鹼）含量低於3 mm厚度生附片。從外觀性狀與生物鹼轉化兩方面評價，生附片厚度為3 mm時更佳。
3.2 不同復水率對微波炮附子乾燥膨化過程與減毒效果的影響
乾燥膨化過程研究結果見圖2，7個生物鹼的含量測定結果見表4。生附片復水率分別為40%、60%、80%、100%時，乾燥時間分別為9、8、11、11 min（圖2-A）。
微波炮附子的DR隨著MR的增加呈現先上升後下降趨勢，且MR在0.6時DR最快。不同復水率微波炮附子平均DR為復水率100%＞復水率60%＞復水率80%＞復水率40%（圖2-B）。不同復水率的微波炮附子耗能規律同不同切片厚度的耗能規律一致，ES增加主要集中在水分較大或較小時（圖2-C）。不同復水率微波炮附子平均ES為1.12、1.12、1.08、1.10 kJ/g，說明復水率對微波炮附子過程中的ES影響不大。
微波功率固定在550 W，生附片的復水率分別設置為40%、60%、80%及100%。實驗結果表明生附片復水率越低，越易炮焦，含水量越高，不易炮焦，且復水率對微波炮附子生物鹼影響較大。微波炮附子中的總生物鹼含量為復水率60%＞復水率80%≈復水率100%＞復水率40%，雙酯型生物鹼含量為復水率60%＞復水率100%＞復水率80%＞復水率40%。
3.3 考察不同微波功率與炮製時間對微波炮附子的影響
不同微波功率作用下，微波炮附子乾燥時間分別為11 min和15 min（圖3-A）。微波炮附子的DR隨著MR的增加呈現先上升後下降趨勢，且微波功率在550 W時其DR大於350 W的DR（圖3-B）。對於ES的影響，微波功率大者明顯高於微波功率小者，平均ES分別為1.08、0.83 kJ/g。
利用紅外成像儀探究微波炮附子過程中微波功率與溫度的關係，發現微波功率越高，升溫越快，且隨著時間的增加，升溫幅度逐漸下降（圖4）。另外，生附片在不同功率下炮製相同時間，微波功率較高的更容易炮過，出現炮焦現象。
微波功率和炮製時間對生物鹼含量的影響結果見表5。隨著炮製時間的增加，雙酯型烏頭鹼含量整體呈下降趨勢，在前2 min雙酯型烏頭鹼水解較為劇烈，隨後含量下降趨於穩定；單酯型生物和醇胺型烏頭鹼含量整體呈上升趨勢。另外，在較低功率（350 W）下，雙酯型烏頭鹼水解趨於穩定需要3 min左右；在550 W功率下，其水解趨於穩定時間約2 min。
4 討論
微波加熱是利用物質中的極性分子，在微波作用下使原有的隨機分布取向變為有序排列，並在高頻電磁場作用下，以同樣速度隨交變電磁場的變化作電場極性運動引起分子運動和轉動，導致分子間頻繁碰撞產生大量摩擦熱，並以熱的形式在物料內表現出來，從而使物料在短時間內加熱、乾燥或熟化[16]。物料中的水分子是強吸收微波的物質，915 MHz的微波可使水分子運動達每秒18.3億次，致使分子急劇摩擦碰撞，使物料產生熱化、膨化、降解等一系列過程[17-18]。微波炮附子是利用微波內部加熱特性，使生附片內部迅速升溫產生大量蒸汽，形成壓力梯度使蒸汽向外擠壓，從而使生附片形成無數微小孔道，組織蓬鬆，呈現蜂巢結構。同時，在微波作用下，水分子的高頻振動以及與周圍分子的劇烈碰撞摩擦，產生大量熱能致使生附片中的雙酯型生物鹼水解，達到安全減毒目的。
研究表明，電磁波透過介質由表到裡傳播時，其所攜帶的能量以指數遞減[19]。微波屬於電磁波的一種，具有較強的穿透力。但是，當物料的厚度、體積超過微波最大穿透能力時，微波很難達到物料中心，只能依靠外部向內部傳熱。同時，微波的能量還易聚集在物料表面和尖角部位，使其溫度快速上升，常導致過度加熱，甚至在其中心部分尚未熟透時表面或尖角部位就會產生焦糊現象。微波炮製過程是先將生附片均勻埋入油砂中再開始炮製。因此當生附片較厚時，微波不能有效穿透生附片，能量聚集在油砂和生附片表面，再通過熱傳導向附片內傳遞，從而造成了生附片表面已經炮焦，內部還未炮熟，雙酯型生物鹼水解不充分的現象。為保證微波炮附子的產品質量，應合理選擇生附片的切片厚度。同時，還應該對油砂在微波炮附子中的作用進行進一步研究。
復水率在微波炮附子過程中非常重要。物料中一般含有自由水和結合水。研究表明，自由水和結合水的損耗因子不同[20]。在加熱過程剛開始時，物料含水量高，自由水分子佔多數，此時其介電常數為負溫度係數；即溫度升高，介電常數下降；當溫度較低時，介電常數大，吸收能量多，隨著溫度升高，介電常數下降，吸收的微波功率自動減少，這種調節有利於物質均勻傳熱[21-22]。但在乾燥後期，自由水已經大部分蒸發，剩下的主要是結合水，此時介電常數變成正溫度係數，即溫度越高，介電常數越大，吸收能量越多。隨著溫度不斷升高，吸收能量隨之增多，易出現「熱失控」風險，導致溫度急劇上升，造成過熱，使產品燒焦，嚴重時甚至著火[23]。合理控制生附片復水率，有助於提高微波炮附子的產品質量。
雙酯型生物鹼是附子中主要的毒性成分和藥效成分，其在炮製過程中的水解變化關係到炮製品的安全性和有效性。以烏頭鹼為代表的劇毒雙酯型生物鹼，水解溫度一般為50～60 ℃。紅外成像數據結果表明，微波加熱1 min後，整個反應體系溫度低於50 ℃，而含量測定結果表明，該時間段內雙酯型生物鹼含量顯著減低，發生了水解轉化。其原因可能是因微波和電磁場作用造成生物鹼與水分子之間劇烈振動和頻繁碰撞，從而導致雙酯型生物鹼發生水解。
文獻表明，雙酯型生物鹼在加熱過程種主要轉化為單酯型生物鹼及醇胺型生物鹼[24-25]；也有文獻報導，不同條件下雙酯型生物鹼還可轉化為焦烏頭鹼、8-乙氧基烏頭鹼以及脫水烏頭原鹼等產物[26-27]。實驗結果表明，雙酯型生物鹼在0～2 min時大量水解，而單酯型生物鹼及醇胺型生物鹼的含量並未立即增加甚至有所下降，2min後，單酯型生物鹼開始劇烈增加。該結果表明，雙酯型烏頭鹼在轉化為單酯型烏頭鹼過程中，可能存在中間產物。另外，烏頭原鹼含量變化趨勢不明顯可能與它在附片中含量較低有關，且由於缺乏新烏頭原鹼及次烏頭原鹼2種醇胺型生物鹼對照品，尚不能確定雙酯型烏頭鹼是否轉化。因此，對於微波條件下雙酯型烏頭鹼水解規律有待做進一步研究。
綜上所述，微波炮附子具有乾燥速度快、受熱均勻、工藝簡便、毒性可控等優勢，在炮製過程還應注意切片厚度、水分含量以及功率對微波炮附子產品質量的影響。
參考文獻（略）
來 源： 賀亞男，陳露夢，黃 偉，劉 霖，李 楠，許潤春，韓 麗，張定堃，楊 明．微波炮附子炮製工藝影響因素研究 [J]. 中草藥, 2020, 51(12):3157-3164.