研究酶的科研汪們都知道，無論是表達一種新酶，還是工程一個現有的酶，都需要對酶的一系列特性進行表徵。在表徵酶功能的眾多性質中Km和Kcat是兩個非常重要的參數，點這裡了解Km和Kcat的意義。小編這次主要介紹Km以及Vmax的測定方法（喂！你上面不是說Kcat嗎，這裡咋冒出了Vmax？ 請點上面連結複習Kcat和Vmax之間的關係）。為了方便後文的介紹，有必要在這裡出現一下米氏方程 （Michaelis-Menten Equation）：
公式中V是酶促反應速率，[S]是底物濃度，Vmax 是最大反應速率，Km為米氏常數。米氏方程可是小編母校研究生面試必考題目，不能忘記!
Lineweaver-Burk 雙倒數法：
自然界中酶有千萬種，但並非所有的酶都遵循米氏方程，為了驗證酶是否遵循米氏方程，我們可以實驗測定在同一酶濃度條件下，不同的底物濃度對應的酶初始反應速率。然後畫出Lineweaver-Burk 雙倒數圖，也就是米氏方程的倒數改寫：
對於遵循米氏方程的酶促反應，1/V與1/[S]之間應該為線性關係，如下圖。
從上圖中我們可以很容易的計算出Vmax和Km:Vmax是線性方程縱截距的倒數，Km是線性方程橫截距倒數的相反數。Lineweaver-Burk雙倒數法通常能夠比較準確的測定出Km與Vmax，但是雙倒數的方法有一個問題，就是低濃度的數據點佔據了過高的權重。在底物濃度很低時，產物生成的速度也很低，因此測定反應速度的精度就很低。如果上面的論述不是很清楚，下面這張圖應該可以更好說明這個問題：
從上圖可以看到最小底物濃度時酶促反應速率很低，所以在1/[S]很大時1/V的數值也很大，這導致低濃度的實驗點佔據了過大的權重，實驗的數據點無法均勻的分布在圖中。為了克服這一缺點，Eadie-Hofstee 做圖法以及Hanes 做圖法相繼被提出。值得一提的是，儘管雙倒數法有這一缺陷，其仍然是學術界最普遍應用的測定米氏常數的方法[1]。
Eadie-Hofstee 做圖法 [2]：
這種方法將米氏方程以如下形式改寫：
v = Vmax - Km x v / [S]
以反應速率V對V/[S]進行做圖，會得到如下圖中的直線：
從圖中可以發現Vmax是線性方程的縱截距，而直線的斜率就是Km的相反數。Eadie-Hofstee方法克服了實驗數據點分布不均的問題，然而這種方法也有一個問題，就是V被用了兩次，既出現在橫坐標也出現在了縱坐標，因此在測量反應速率時出現的誤差會被疊加，這會導致檢測Km 與 Vmax 的準確度降低。
Hanes 做圖法：
Hanes做圖法以如下形式重排米氏方程：
[S] / v = Km / Vmax + [S] / Vmax
以[S] / v對[S]做圖會得到下面的直線:
從圖中可知Y截距是 Km / Vmax，直線斜率是 1 / Vmax，X截距是Km的相反數。
這種方法同樣克服了實驗室數據點分布不均以及低濃度點過高權重的問題，但是從圖中可以發現[S]被使用了兩次，橫縱坐標中都有底物濃度的參與。與Eadie-Hofstee 做圖法類似，這會導致底物濃度測定過程中產生的誤差被疊加。底物濃度測定產生的誤差主要來自於微量移液器的使用（計算錯誤這種問題就不討論了啊！），因此除非你有極高的移液器使用技巧，否則不推薦使用本方法。
非線性擬合：
通過對上面方法的了解，似乎倒數法中的每種方法都有弊端。那我們不妨回歸到開始，米氏方程是這樣的:
我們為什麼不能直接將V與[S]進行非線性擬合到米氏方程，從而直接獲得Vmax 以及 Km呢？事實上，這種非線性擬合的方法相對於倒數法更準確。非線性回歸是在對變量的非線性關係有一定認識前提下，對非線性函數的參數進行最優化的過程，最優化後的參數會使得模型的殘差平方和達到最小。
非線性擬合相對於雙倒數法的麻煩之處在於測量酶的反應速率時底物濃度的選擇要儘量多，並且要覆蓋米氏方程曲線的三個區域：一級反應區，反應速率隨底物濃度增加而直線增加；混合級反應區域，趨於平緩；最後是零級反應區域，反應速率不再隨底物濃度增加而增加。只有選擇的實驗點完整的覆蓋這些區域，擬合出來的米氏方程才是準確的。
用於非線性回歸分析的軟體很多，比如Sigmaplot， Matlab， Orgin等等。下面我們以OrginPro9.0為例，看一下如何利用Origin做圖軟體擬合米氏方程並獲得方程中的兩個常數Vmax以及Km。
1. 首先新建一個數據表，將底物濃度與反應速率的數據輸入，設定底物濃度為橫坐標X，反應速率的縱坐標Y
2. 全選X 與Y坐標數據，然後選擇菜單欄Analysis: Fitting: Nonlinear Curve Fit：Open Dialog
3. 在Setting：Function Selection頁面內的Category選擇Pharmacology, Function選擇米氏方程（MichaelisMenten）, 而後點擊Fit便可得到擬合結果了。注意：Origin 8.0以前的版本中沒有保存米氏函數，大家可以選擇Hill函數。Hill函數如下：
當Hill函數中的n等於1時，該函數就變成了米氏方程。
4. 非線性擬合結束後即可查看擬合結果報告，從Summary一欄中我們可以知道通過本次實驗數據計算得到的最大反應速率Vmax是4.51mM/min，米氏常數Km是23.26mM。結果報告中同時給出了計算所得數據的誤差（standard error），比如Vmax的誤差0.40884。 我們也可以在報告中查看擬合結果的準確性, 衡量擬合效果最常用的指標是R2 ，本次擬合的R square等於0.95757。另外我們也可以在擬合報告中查看擬合獲得的圖形（見下圖）。
總結：
Lineweaver-Burk雙倒數法是常用的測定酶米氏常數Km的方式，然而由於其低濃度數值引起的實驗點分布不均的問題常導致測定結果不準確。Hanes 做圖法以及Eadie-Hofstee 做圖法克服數據點分布不均的問題，但兩種方法的準確性受實驗操作誤差影響極大。
倒數法的另一個問題就是無法處理0以及負數的數據點。在測定反應速率時我們有時需要減去空白對照，這時所得的數偶爾是0或者負數。但是在倒數法中V和[S]處在分母的位置，這些數據點是無法用倒數法處理的。非線性擬合是一種相對準確的測定動力學常數的方法，同時能夠處理0或負數的數據點，但是需要檢測足夠的數據點以便覆蓋曲線的全部區域。有文獻報導, 為了計算得到相對準確的Km值，需要至少10個數據點 [3]。
參考文獻:
[1] Markus, M, Hess, B, Ottway, J H and Cornish-Bowden, A (1976) FEBS Letters 63, 225-230
[2] Hofstee, B H J (1959) Nature 184, 1296-1298
[3] Ritchie R J, Prvan T. Current statistical methods for estimating the Km and Vmax of Michaelis‐Menten kinetics[J]. Biochemical Education, 1996, 24(4): 196-206.
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