（聽課本）
（邊看邊結合課本總結知識點）
教學過程
(對自己總結的知識點進行整理)
1、易混易錯
（1）生物體內DNA複製與PCR反應的區別
體內DNA複製
PCR反應
解旋
在解旋酶作用下，細胞提供能量，部分解開
加熱至90 ℃，雙鏈全部解開，不需要解旋酶
引物
一小段RNA
可以是RNA或單鏈DNA分子片段
合成子鏈
在引物基礎上，一條鏈連續合成，另一條鏈不連續合成
分別從兩條鏈的引物端開始，都是連續合成，控制溫度72 ℃
特點
邊解旋邊複製，半保留複製
體外迅速擴增
Taq DNA聚合酶
不需要
需要
循環次數
受生物體自身控制
30多次
相同點
生物體內的DNA複製和PCR體外DNA擴增都需要模板、四種脫氧核苷酸，且都需要在一定的緩衝溶液中進行
2、要語強記
（1）PCR利用了DNA雙鏈複製和DNA熱變性的原理。
（2）PCR反應每次循環可分為變性（95℃）、復性（55℃）和延伸（72℃）三步，反應需在一定的緩衝液中進行，需提供DNA模板、兩種引物、四種脫氧核苷酸、耐高溫的DNA聚合酶（TaqDNA聚合酶）。
3、知識點整理（自己整理）
Part 4 書本旁欄思考蘭及課後習題答案（先做後訂正）
練習
1.提示：繪圖可參考教科書中圖5-9。PCR反應中的目的片段一般以2n的方式積累，其中n為反應循環次數。一個DNA片段在30次循環後反應物中大約有10億個這樣的片段（2n=230=1 073 741 824)。
2.提示：PCR引物是根據需要擴增的目標DNA的鹼基序列來設計的。引物的設計需要豐富的分子生物學實驗經驗
(脫離書本，自己繪製思維導圖，多繪幾次)
（先做題，然後參考答案進行訂正，做錯的題要回到書本找到對應知識點，並在書本上進行標記）
專題5 DNA和蛋白質技術
課題2 多聚酶鏈式反應擴增DNA片段
1.下列有關PCR的描述不正確的是 ( )
A.是一種酶促反應
B.引物可決定擴增的特異性
C.PCR技術利用了DNA的熱變性原理
D.擴增對象是胺基酸序列
2.完成一次PCR實驗所不需要的條件是 ( )
A.人工合成引物 B.三磷酸腺苷
C.DNA聚合酶 D.游離的脫氧核苷酸
3.PCR實驗的具體操作順序應為 ( )
①設計好PCR儀的循環程序 ②按配方準備好各組分 ③用微量移液器向微量離心管中依次加入各組分 ④進行PCR反應 ⑤離心使反應液集中在離心管底部
A.②③⑤④① B.①⑤③②④
C.②③⑤①④ D.④②⑤③①
4.在PCR實驗操作中,下列說法不正確的是 ( )
A.在微量離心管中添加各種試劑時,只需一個槍頭
B.離心管的蓋子一定要蓋嚴,防止液體外溢
C.用手輕彈離心管壁的目的是使反應液充分混合
D.離心的目的是使反應液集中在離心管底部,提高反應效率
5.PCR實驗中使用的微量離心管、槍頭、緩衝液以及蒸餾水使用前必須進行的關鍵步驟是 ( )
A.反覆洗滌
B.不必擔心外源DNA汙染
C.高壓滅菌
D.在-20 ℃下儲存
6.圖L5-2-1是PCR擴增過程中第幾次循環的產物 ( )
圖L5-2-1
A.第一次 B.第二次
C.第三次 D.第四次
7.引物是DNA複製必需的條件之一,其主要原因是 ( )
A.可加快DNA的複製速度
B.引物可與DNA母鏈通過鹼基互補配對結合
C.引物的5'端有助於DNA聚合酶延伸DNA鏈
D.DNA聚合酶只能從3'端延伸DNA鏈
8.圖L5-2-2表示PCR擴增某個DNA的基本過程,有關敘述正確的是 ( )
圖L5-2-2
A.PCR技術的主要原理是DNA複製,解旋酶和DNA聚合酶分別在圖中①③兩步中起作用
B.據圖分析,PCR操作過程中使用的DNA聚合酶至少要能忍受72 ℃的高溫
C.PCR反應需要提供分別與兩條模板鏈相結合的兩種引物
D.因為引物不能重複使用,所以在第n輪擴增過程中至少消耗2n-1個引物
9.下列關於DNA聚合酶催化合成DNA子鏈的說法中,正確的是 ( )
A.DNA聚合酶是以DNA為模板,使DNA子鏈從5'端向3'端延伸的一種酶
B.Taq DNA聚合酶必須在每次高溫變性處理後再添加
C.DNA聚合酶能特異性地複製整個DNA的全部序列
D.Taq DNA聚合酶是從深海生態系統中發現的
10.關於PCR技術的應用範圍,錯誤的一項是 ( )
A.古生物學、刑偵破案、DNA序列測定
B.診斷遺傳疾病、基因克隆、古生物學
C.DNA序列測定、基因克隆、刑偵破案
D.診斷遺傳疾病、合成核苷酸、DNA序列測定
11.PCR技術是把一個DNA分子的片段在體外酶的作用下,合成許許多多相同片段的一種方法,利用它能快速而特異性地擴增任意的目的基因或DNA分子片段,它的基本過程如圖L5-2-3所示:
注:圖中短線表示每次擴增過程中需要的引物。每個引物約含20個核苷酸,並分別與兩條單鏈DNA結合,其作用是引導合成DNA子鏈。
圖L5-2-3
(1)PCR技術的原理是模擬生物體內 的過程。
(2)PCR擴增過程中需要對DNA片段進行高溫處理,其目的是 。此過程在生物體內稱為 ,需 酶的參與。
(3)假如引物都用3H標記,從理論上計算,所得DNA分子中含有3H標記的佔 。
12.多聚酶鏈式反應(PCR)是一種體外迅速擴增DNA片段的技術。請回答下列有關PCR技術的基本原理及應用的問題:
(1)DNA的兩條鏈是反向平行的,通常將 的末端稱為5'端,當引物與DNA母鏈通過鹼基互補配對原則結合後,DNA聚合酶就能從引物的 開始延伸DNA鏈。
(2)PCR利用DNA的熱變性原理解決了打開DNA雙鏈的問題,但又導致了DNA聚合酶失活的新問題。到20世紀80年代,科學家從一種Taq細菌中分離到了 ,它的發現和應用解決了上述問題。要將Taq細菌從其他普通的微生物中分離出來,所用的培養基叫 。
(3)PCR的每次循環可以分為 三步。假設在PCR反應中,只有一個DNA片段作為模板,則在5次循環後,反應物中大約有 個這樣的DNA片段。
(4)請用簡圖表示出一個DNA片段在PCR反應中第二輪的產物。
13.請回答PCR方面的有關問題:
(1)引物是擴增過程中必須加入的物質,從化學本質上說,引物是一小段 。
(2)引物是子鏈合成中延伸的基礎,如圖L5-2-4所示。
圖L5-2-4
從理論上推測,第二輪循環產物中 (填「出現」或「不出現」)兩條脫氧核苷酸鏈等長的DNA片段。
(3)在DNA聚合酶的作用下,兩條子鏈的延伸方向都是 。
(4)與體內DNA複製相比,PCR反應體系除引物外,還需加入哪種特別的物質? 。
14.在遺傳病及刑偵破案中常需要對樣品DNA進行分析,PCR技術能快速擴增DNA片段。圖L5-2-5為某一次循環的產物,請據圖回答問題:
圖L5-2-5
(1)DNA的羥基(—OH)末端稱為 ,圖中所示的羥基端為 (填字母)。
(2)以引物為標記,可判斷出此產物最早為第 次循環的產物。一次循環包括的三個環節是 。
(3)請根據圖L5-2-6,在橫線處寫出引物Ⅱ。
圖L5-2-6
(4)若將作為原料的四種脫氧核苷酸用32P標記,循環n次後生成的DNA分子中不含放射性的單鏈佔總單鏈的比例為 。
(5)PCR與人體內DNA複製相比,有哪些不同? (答出2項)。
15.PCR(多聚酶鏈式反應)技術是一項在生物體外擴增特定DNA片段的技術,如圖L5-2-7表示體外DNA片段的擴增過程,請據圖分析回答:
圖L5-2-7
(1)A過程中高溫使DNA變性,對該過程的原理的敘述,正確的是 ( )
A.該過程用耐高溫的解旋酶破壞氫鍵
B.該過程用限制酶破壞磷酸二酯鍵
C.該過程不需要解旋酶的作用
D.該過程與人體細胞內發生的DNA複製過程完全相同
(2)C過程要用到的酶是 。這種酶在高溫下仍保持活性,因此在PCR擴增時可以 加入,以後 (填「需要」或「不需要」)再添加。PCR反應除需提供酶外,還需要滿足的基本條件有 。
(3)如果把模板DNA的兩條鏈用15N標記,游離的脫氧核苷酸不做標記,控制「95 ℃→55 ℃→72 ℃」的溫度循環3次,則在形成的子代DNA分子中含有15N標記的DNA分子佔 。
(4)PCR中由鹼基錯配引起的變異屬於 。對一段DNA片段進行擴增,若第一次循環時某一條模板鏈上的鹼基發生突變,則擴增若干次後檢測所有DNA的擴增片段,與原DNA相應片段相同的佔 。
(5)如果模板DNA分子共有a個鹼基對,其中含有胞嘧啶m個,則該DNA複製10次,需要加入胸腺嘧啶脫氧核苷酸 個。
課題2 多聚酶鏈式反應擴增DNA片段
1.D [解析] PCR是一種體外迅速擴增DNA片段的技術。它利用DNA的熱變性和雙鏈複製的原理,以極少量的DNA為模板,以四種脫氧核苷酸為原料,在DNA聚合酶的作用下從引物的3'端開始連接脫氧核苷酸,短時間內複製出上百萬份的DNA拷貝。
2.B [解析] PCR反應必需的條件有DNA模板、四種脫氧核苷酸原料、熱穩定DNA聚合酶、兩種引物等,不需要三磷酸腺苷(ATP)。
3.C [解析] PCR實驗的操作步驟一般為準備(包括配製配方及將各配方放於實驗臺上)→移液→混合→離心→反應,因PCR儀是一種自動控制溫度的儀器,設計好循環程序就可以進行反應了。
4.A [解析] 向微量離心管中添加各種試劑時,每吸取一種試劑後,移液器上的槍頭必須更換,以確保實驗的準確性;離心管的蓋子一定要蓋嚴,防止實驗中液體外溢;離心10 s 的目的是使反應液集中在離心管底部,提高反應效率。
5.C [解析] PCR技術高度靈敏,極其微量的靶基因汙染都會造成非目標DNA片段的大量擴增,因此,PCR實驗中使用的微量離心管、槍頭、緩衝液以及蒸餾水使用前必須進行高壓滅菌。
6.A [解析] 在PCR反應中,以引物為標記,第一次循環時,以加入的DNA分子為模板,引物Ⅰ和引物Ⅱ分別與DNA分子的兩條鏈結合併在DNA聚合酶的作用下延伸,所以形成的每個子代DNA中只有一種引物;從第二次循環開始,上次產生的DNA分子又可作為模板參與反應,所以會形成DNA分子兩端均含引物的情況,如圖所示:
因此,題幹中所出現的是第一次循環的產物。
7.D [解析] DNA聚合酶不能從頭合成DNA,而只能從3'端延伸DNA鏈。
8.C [解析] PCR技術的主要原理是DNA複製,PCR過程中通過高溫變性而達到解旋的目的,不需要解旋酶,A項錯誤;PCR操作過程中使用的DNA聚合酶至少要能忍受95 ℃的高溫,B項錯誤;PCR反應需要提供分別與兩條模板鏈相結合的兩種引物,C項正確;因為引物不能重複使用,所以在第n輪擴增過程中至少消耗2×2n-1=2n(個)引物,D項錯誤。
9.A [解析] 本題主要考查DNA聚合酶在PCR技術中的作用及特點。DNA聚合酶不能從頭開始合成DNA,而只能從引物的3'端延伸子鏈;Taq DNA聚合酶能耐高溫,所以在反應體系中可反覆利用,無須高溫變性後再添加;PCR擴增的是引物之間的固定長度的DNA序列;Taq DNA聚合酶是從美國黃石國家公園一個熱泉的某種菌體內發現的。
10.D [解析] PCR技術能以極少量的DNA為模板,在幾小時內複製出上百萬份的DNA拷貝。這項技術有效地解決了因為樣品中DNA含量太低而難以對樣品進行分析研究的問題,被廣泛應用於遺傳疾病的診斷、刑偵破案、古生物學、基因克隆、DNA序列測定等各個方面,但不能用於合成核苷酸。
11.(1)DNA複製 (2)使DNA的兩條鏈彼此分開 解旋 解旋 (3)100%
[解析] (1)PCR技術的原理是模擬生物體內DNA複製的過程。(2)PCR擴增過程中,通過高溫處理使DNA分子兩條鏈之間的氫鍵斷開,從而使兩條鏈分開,該過程在生物體內稱為解旋,需要解旋酶的參與。(3)若引物用3H標記,不論循環多少次,所合成的DNA分子都具有放射性,即DNA分子中含有3H標記的佔100%。
12.(1)磷酸基團 3'端
(2)耐高溫的Taq DNA聚合酶 選擇培養基
(3)變性、復性和延伸 32
(4)如圖所示
[解析] (1)DNA聚合酶只能把新的脫氧核苷酸加到已經存在的DNA單鏈的3'端的羥基上,與DNA母鏈結合的引物就提供這個羥基。(2)因PCR利用DNA的熱變性原理解決了打開DNA雙鏈的問題,所以用於催化DNA複製的DNA聚合酶要具有耐高溫的特性。用選擇培養基可將Taq細菌從其他普通的微生物中分離出來。(3)DNA複製時兩條鏈均作為模板,進行半保留複製,所以複製5次後得到的子代DNA分子數為25=32(個)。(4)新合成的DNA鏈帶有引物,而最初的模板DNA的兩條鏈不帶有引物。
13.(1)DNA或RNA (2)不出現
(3)從子鏈的5'端向3'端延伸
(4)Taq DNA聚合酶
[解析] (1)PCR中的引物是一小段DNA或RNA。(2)由於題圖中的引物A和引物B均不在該片段的端點,因此第一輪循環後,得到的兩個DNA片段中兩條脫氧核苷酸鏈都不等長;通過繪圖可推知,第二輪循環產物中不會出現兩條脫氧核苷酸鏈等長的DNA片段。(3)在DNA聚合酶的作用下,子鏈的延伸方向是從子鏈的5'端向3'端延伸。(4)與體內DNA複製相比,PCR反應體系除引物外,還需加入Taq DNA聚合酶。
14.(1)3'端 A、D
(2)一 變性、復性和延伸
(3)5'—G—A—OH
(4)1/2n
(5)PCR在體外發生;高溫作用下解旋;DNA聚合酶能耐高溫
[解析] (1)DNA的羥基(—OH)末端稱為3'端。由於在DNA聚合酶的作用下,DNA的合成方向總是從子鏈的5'端到3'端,可判斷圖中所示的羥基端為A、D。(2)圖示中,引物已結合到子代DNA分子中,且每個DNA分子中有一條鏈不含引物,可判斷出此產物最早為第一次循環的產物。PCR一次循環包括的三個環節是變性、復性和延伸。(3)由於引物Ⅰ和引物Ⅱ位於DNA片段的兩端,且與DNA分子的兩條鏈分別配對,可寫出引物Ⅱ為5'—G—A—OH。(4)DNA分子複製方式是半保留複製,若將作為原料的四種脫氧核苷酸用32P標記,循環n次後生成的DNA分子共2n個,共有脫氧核苷酸鏈2×2n條,其中不含放射性的單鏈是親代DNA分子的脫氧核苷酸鏈,共2條,佔總單鏈的比例為1/2n。(5)PCR與人體內DNA複製相比,不同之處在於PCR在體外發生、高溫作用下解旋、DNA聚合酶能耐高溫等。
15.(1)C
(2)Taq DNA聚合酶 一次性 不需要 加入DNA模板、分別與兩條模板鏈相結合的兩種引物、四種脫氧核苷酸,同時通過控制溫度使DNA複製在體外一定的緩衝溶液中反覆進行
(3)25%
(4)基因突變 50%
(5)(210-1)(a-m)
[解析] (1)PCR過程中,高溫所起的作用類似於解旋酶的作用,即使雙鏈DNA變為單鏈。(2)C過程為PCR技術的延伸階段,當系統溫度上升至72 ℃左右時,溶液中的四種脫氧核苷酸在DNA聚合酶的作用下根據鹼基互補配對原則合成新的DNA鏈。DNA聚合酶是耐熱的,高溫下不變性,所以一次性加入即可。(3)PCR技術遵循DNA半保留複製的特點。經過三次循環,共產生23個 DNA分子,其中有2個DNA分子含有15N標記。(4)基因中的鹼基對改變屬於基因突變。對一段DNA片段進行擴增,若第一次循環時某一條模板鏈上鹼基發生突變,以後按正常配對方式進行擴增,以突變鏈作模板擴增得到的都是突變的DNA分子,以原正常鏈為模板擴增得到的都是正常的DNA分子,故擴增若干次後檢測所有DNA的擴增片段,與原DNA相應片段相同的佔50%。(5)在一個雙鏈DNA分子中,C+T佔鹼基總數的一半,故T的數目為a-m,該DNA分子複製10次,相當於新增加(210-1)個DNA分子,故需要加入胸腺嘧啶脫氧核苷酸(210-1)(a-m)個。