「實驗」PCR擴增目的片段

2020-12-17 小客生活

一、實驗目的

1.掌握PCR反應的原理。

2.掌握PCR反應操作及PCR儀的使用。

二、實驗原理

1.PCR的基本原理

聚合酶鏈式反應（Polymerase Chain Reaction，PCR）：是體外酶促合成特異DNA片段的一種方法，又稱無細胞分子克隆或特異性DNA序列體外引物定向酶促擴增技術。它不僅可用於基因分離、克隆和核酸序列分析等基礎研究，還可用於疾病的診斷。

PCR基本原理：類似於DNA的體內複製。在模板DNA、引物和4種脫氧核苷酸存在條件下依賴於DNA聚合酶的酶促合成反應。

PCR的基本步聚：

1、變性(Denaturation)：通過加熱使DNA雙螺旋的氫鍵斷裂，雙鏈解離形成單鏈DNA。

2、退火(Annealing)：當溫度突然降低時，反應體系中引物和其互補的DNA模板在局部形成雜交鏈。

3、延伸(Extension)：在DNA聚合酶和4種脫氧核苷酸(dATP、dCTP、dGTP、dTTP)及Mg2+存在條件下，5』→3』的聚合酶催化以引物為起始點的DNA鏈延伸反應。

這種熱變性-復性-延伸的過程就是一個PCR循環，PCR就是在合適條件下的這種循環的不斷重複。

①模板DNA的變性：模板DNA經加熱至95℃左右一定時間後，使模板DNA雙鏈或經PCR擴增形成的雙鏈DNA解離，使之成為單鏈，以便它與引物結合，為下輪反應作準備；

②模板DNA與引物的退火(復性)：模板DNA經加熱變性成單鏈後，溫度降至55℃左右，引物與模板DNA單鏈的互補序列配對結合；

③引物的延伸：DNA模板--引物結合物在Taq DNA聚合酶的作用下，以dNTP為反應原料，靶序列為模板，按鹼基配對與半保留複製原理，合成一條新的與模板DNA鏈。

每完成一個循環需2-4min，2-3h就能將待擴目的基因擴增放大幾百萬倍。

三、儀器與試劑

PCR儀

PCR反應體系：

PCR反應成分：引物、Taq DNA聚合酶、4種dNTP混合物、Mg2+、10×緩衝液

1）模板：pET30a質粒DNA

一般100ng DNA模板/100L。模板濃度過高會導致反應的非特異性增加。最好做濃度梯度對照從而確定最佳條件。

2）引物

a.濃度：0.1-0.5M（濃度過高易導致模板與引物錯配，反應特異性下降）

b.上遊引物序列：5-TAATACGACTCACTATAGGG-3

下遊引物序列：5-GCTAGTTATTGCTCAGCGG-3

引物是PCR特異性反應的關鍵；

PCR產物的特異性取決於引物與模板脫氧核糖核酸互補的程度；

人工合成的寡聚核苷酸引物需經離子交換HPLC進行純化。

3）Taq DNA聚合酶：一般0.5-2.5 U/50μl

酶量過少影響反應產量；濃度過高可引起會造成雜帶、特異產物帶不清晰等不好的結果，濃度過低則得不到所需的產物。最可靠的做法是先做濃度對照,再根據結果決定最佳條件。

4）dNTP(dATP、dCTP、dGTP、dTTP）

dNTP濃度取決於擴增片段的長度；

四種dNTP濃度應相等；

PCR常用的濃度為50-200μM，不能低於10-15μM。

濃度過高會抑制Taq酶的活性，易產生錯誤鹼基的摻入，濃度過低則降低反應產量。

5）10×PCR緩衝液 (Mg2+)：500 mM KCl，100 mM Tris-HCl (pH 8.4)，150 mM MgCl2，1 mg/ml明膠。

四、實驗步驟

1.PCR反應體系：總體積30μl

2 x premix Taq：15μl

上遊引物：1.5μl

下遊引物：1.5μl

質粒DNA模板：2μl

雙蒸水：10μl

2.PCR擴增程序：

98℃：3min

98℃：10S

58℃：10S

72℃：15S（第二到第三步30cycles）

72℃：2min

相關焦點

  • 圖解利用PCR技術擴增目的基因的過程
    比如，一個學生問了我一道題，題目是：從基因組資料庫中查詢幹擾素基因的核苷酸序列，以便根據其序列設計合成引物用於PCR擴增，PCR擴增過程至少第   輪循環後才能獲得純目的基因片段（僅含引物之間的序列）。這是蘇州市2018屆高三調研中的一道題，當時我並沒有布置這道題做為作業，但這名學生對生物很感興趣，他自己在做題過程中發現了問題。
  • 【分子】目的基因的擴增——PCR原理與過程
    後臺回復「分子」查詢分子生物學系列內容【分子生物學實驗初階】分子生物學之PCR篇【分子】目的基因的擴增
  • 實驗時間 | RT-PCR 的常見問題及解答
    近期，鑑於很多小夥伴，在實驗過程中遇到各種疑難雜症，找不到夥伴交流，學霸君專門為大家建立了實驗問答專欄，歡迎大家一起來交流和提問，
  • PCR技術應用之一---基因定點突變的原理
    通過上圖可以發現，只要設計出DNA上某一段片段（本圖也就是藍色的目的基因片段）兩側的一對方向相反的引物，那麼這一對引物，所夾的那段（本圖就是目的基因）經過至少三輪的DNA複製（擴增）就會得到中間的那段目的基因。
  • 【選修一導學】 5.2 多聚酶鏈式反應擴增DNA片段
    PCR反應中的目的片段一般以2n的方式積累，其中n為反應循環次數。一個DNA片段在30次循環後反應物中大約有10億個這樣的片段（2n=230=1 073 741 824)。2.提示：PCR引物是根據需要擴增的目標DNA的鹼基序列來設計的。
  • 「科學盒子」課程系列2|DNA的粗提取和PCR的擴增技術
    PCR一般指聚合酶鏈式反應，所以可以簡單理解為PCR擴增技術就是把一小部分DNA無線擴增的技術。有了這項技術我們就可以把僅有的DNA擴增，例如把恐龍的DNA擴增，哇塞，我的寵物可不可以是恐龍呢？想想都很激動呢。首先我們要製作底物與引物，先用雙面膠對磁鐵的正極或負極做標記，將磁體粘在膠帶上製作出底物與引物。之後再將幾種不同的引物與底物匹配，再將下方掛上紙杯放入砝碼。
  • 實驗教程|RT-PCR操作
    ，而獲得目的基因或檢測基因表達。擴增：設定PCR程序。在適當的溫度參數下擴增28~32個循環。為了保證實驗結果的可靠與準確，可在PCR擴增目的基因時，加入1對內參（如β-肌動蛋白）的特異性引物，同時擴增內參DNA，作為對照。電泳鑑定:進行瓊脂糖凝膠電泳，紫外燈下觀察結果。
  • PCR中不同類型DNA詳解聚合酶的特徵
    該產品穩定性好，特別適合用於大規模基因型檢測，半定量PCR實驗和微量DNA的檢測；也適用於從複雜模板中如基因組中擴增PCR產物，如表達基因的克隆，基因的定點突變和細胞內基因點突變的分析（SNP）等。使用λDNA、質粒等簡單模板，Phanta® Max可以有效擴增長達40 kb的片段；使用基因組DNA等複雜模板，Phanta® Max可以有效擴增長達20 kb的片段；使用cDNA模板，Phanta Max可以有效擴增長達10 kb的片段。其擴增錯配率是普通Taq聚合酶的1/53，是Pfu聚合酶的1/6。
  • PCR技術的精髓,看這裡!
    許多生物實驗室都會進行PCR實驗，正確掌握PCR的原理及檢測方法對我們的科研將是如虎添翼。 PCR (polymerase chain reaction)聚合酶鏈式反應，又稱體外DNA擴增技術，在1985年由美國Cetus公司的Kary Mullis首創，可以將微量目的DNA片段擴增一百萬倍以上。Kary Mullis本人因此獲1993年諾貝爾化學獎。
  • 10種常用的PCR方法,您都熟悉嗎?
    低擴增能力和高擴增能力的DNA聚合酶擴增3.8 kb人類gDNA片段的效果對比。使用兩步PCR方案（退火和延伸步驟合併）。當使用低擴增能力的DNA聚合酶（如Taq酶）擴增<500 bp片段時，快速擴增有可能實現。擴增如此大小的片段通常不需要延長聚合時間，所以可以縮短PCR方案中的延伸步驟。為了找到最短的延伸時間而不影響PCR產量，需要進行一系列的延伸時間遞減的PCR實驗。
  • PCR這麼多應用,你知道幾個?
    PCR的過程中目的DNA片段的增加數量符合以下理論公式：                                Y(目的片段)=M*2＾n(n: PCR循環數)例如,模板共有100個,那麼30輪循環後,將有100*2＾30=107,374,182,400個目的片段。
  • 總結,PCR方法—常用的10種策略
    PCR實驗包括三大主要的熱循環步驟 ，在這個過程中需要多種必要的反應成分 ，通過對PCR的設置做相應的調整，便可以獲得一些特殊的實驗結果，如產率提高，特異性增強或反應時間縮短等。表 1.常用PCR方法及其核心優勢熱啟動PCR常用於增強PCR擴增的特異性。
  • RT-PCR 結果竟然不可信?這點你注意到了嗎
    每天駐紮在實驗室做實驗已經很不容易了，這時候有人潑涼水，猛得來一句：
  • PCR技術
    DNA片段的分子生物學技術，它可看作是生物體外的特殊DNA複製。每完成一個循環需2～4分鐘，2～3小時就能將待擴目的基因擴增放大幾百萬倍。5′端引物與位於待擴增片段5′端上的一小段DNA序列相同；3′端引物與位於待擴增片段3′端的一小段DNA序列互補。[引物設計的幾個要求]：①引物長度： 15-30bp，常用為20bp左右。
  • 重大突破|日本科學家建立新式PCR擴增方法,能在常溫37°C快速擴增DNA
    這項技術可在試管內的經數小時反應就將特定的DNA片段擴增數百萬倍，這種迅速獲取大量單一核酸片段的技術在分子生物學研究中具有舉足輕重的意義，極大地推動了生命科學的研究進展。 近日，來自東京工業大學、雅培日本以及日本電氣通信大學的研究者報導了一種能夠在常溫（37°C/98.6°F）實現對DNA進行百萬倍擴增和雜交的方法。
  • 【專題】RT-PCR原理與實驗技術
    在引物設計時要充分考慮到可能存在的同源序列，同種蛋白的不同亞型，不同的mRNA剪切方式以及可能存在的hnRNA對引物的特異性的影響。儘量選擇覆蓋相連兩個內含子的引物，或者在目的蛋白表達過程中特異存在而在其他亞型中不存在的內含子。
  • 網絡時代的PCR儀 - Mastercycler nexus
    在實驗性能上，Mastercycler nexus秉承了Eppendorf PCR儀在溫度均一性和溫控準確性上的出眾表現，確保PCR實驗結果的可靠性和重複性。先進的flexlidTM熱蓋，可自動調節高度，適應各種PCR耗材，從小體積PCR管、0.2ml/0.5 ml PCR管到各種規格的PCR板，讓您在實驗耗材的選擇上靈活自如。
  • 知識點:德國MB螢光定量pcr檢測原理
    螢光定量PCR法（qPCR）：是在常規PCR基礎上，將『針對支原體特異性保守序列的探針』做螢光標記，使PCR擴增後的產物帶有螢光，利用螢光信號的變化和配套軟體，進行DNA擴增反應的實時監測，簡稱qPCR。本文締一生物為您做以下分析。
  • PCR技術的原理與方法(2)
    高濃度可加速反應，但同時增加錯誤摻入和實驗成本；低濃度可提高精確性，而反應速度會降低。（五）Taq酶：能耐95℃高溫而不失活，其最適pH值為8.3～8.5，最適溫度為75～80℃，一般用72℃。能催化以DNA單鏈為模板，以鹼基互補原則為基礎，按5』→3』方向逐個將dNTP分子連接到引物的3』端，合成一條與模板DNA互補的新的DNA子鏈。無3』→5』的外切酶活性，沒有校正功能。