Q：壽命值的意義再解釋一下麼？衰變曲線上應該怎麼理解呢
A：螢光壽命是指螢光分子停留在激發態的時間，每一個光子的壽命可能是不一樣的。而衰變曲線上的螢光壽命是指很多個光子的平均螢光壽命。
Q：FRET消失，為什麼供體的壽命會增加？
A：如果發生FRET，供體的螢光壽命和單獨供體的螢光壽命相比是縮短的。那麼如果FRET消失，供體的螢光壽命相對於發生FRET的樣品當中的供體螢光壽命就是增加的。
Q：剛剛那個HIV的例子，有兩個圖，FRET的螢光曲線上升，FLIM的曲線下降，這個怎麼理解，可以再講講嗎？
A：第一個圖是供體和受體螢光強度的比值，隨著病毒濃度增加，FRET發生率逐漸下降，所以供體和受體螢光強度的比值葉隨之上升；第二個圖是發生FRET的供體比率，它會隨著FRET發生率的下降而下降。所以這兩個圖的結果是一致的。（具體可見Quantitative FRET-FLIM-BlaM toAssess the Extent of HIV-1 Fusion in Live CellsQ：Viruses 2020, 12(2), 206; https://doiQ：org/10Q：3390/v12020206）
Q：實現螢光壽命測量，有很多方法，頻域的和時域的，那麼在做FLIM-FRET的時候，一般會考慮使用哪類方法呢？
A：這兩類方法都可以使用。通常在共聚焦上都採用時域中的TCSPC（時間分辨單光子計數）方法。使用哪一種主要看實驗室的配置吧。
Q：通過表格可以看到，不同蛋白質的壽命不一樣，但同時也挺接近，零點幾個ns的區別，那麼這點壽命的區別足夠區分不同蛋白質嗎？可信度有多高呢？/不同螢光蛋白間的壽命差異很小，足夠區分不同螢光蛋白質嗎？
A：我們在採圖的時候，同時獲取了螢光壽命和螢光光譜的信息，二者結合起來，足夠區分壽命接近的不同的螢光蛋白了。
Q：做FRET時，為什麼R0越長越好呢？
A：也不是越長越好，而是建議選擇R0比較長的螢光染料/蛋白對。如果R0太短，而我們想研究的分子尺寸又比較大，會導致兩個螢光染料/蛋白的距離無法靠得很近，就有可能比較難觀察到FRET的發生。
Q：請問您認為FLIM目前的發展前景或者瓶頸在哪些方面呢？
A：FLIM可以在螢光強度和螢光光譜成像之外，提供螢光壽命的維度，能提供分子結合、分子所處微環境等信息，還能用於拆分串色的染料或染料和自發螢光等，有很廣闊的應用前景。
我們在做螢光成像的時候，使用的樣品不同，實驗目的也可能不同，所以更希望FLIM能滿足各種樣品和各種實驗目的的需求，比如獲取活細胞快速成像、厚樣品深部成像、大樣品拼接等的螢光壽命信息，因此多種成像模式的相互結合是將來的發展方向，這也對FLIM的速度、成像深度、拼圖等方面提出了要求。
光鏡機組儀器
· 受激發射損耗超高解析度共聚焦顯微鏡
Leica TCS SP8 gSTED 3X（17002186）
· 倒置雷射共聚焦顯微鏡Zeiss
LSM710 3-channel（12027558）
· 倒置雷射共聚焦顯微鏡
Zeiss LSM710 META（09018326）
· 全自動數字玻片掃描系統
Zeiss Axio Scan. Z1（17026728）
· 全自動數字玻片掃描系統
3DHISTECH Pannoramic Scan（A18000062）
· 全自動活細胞顯微成像系統
Nikon Ti2-E（A18000063）
· 活細胞工作站
Olympus IX81（10005154）
· 全內反射顯微鏡
Olympus IX83（17005698）
· 螢光光鑷系統
Lumicks C-Trap G2（A19000044）
· 高配置的數據處理工作站和專業的分析軟體
電鏡機組儀器
· 透射電子顯微鏡日立
H-7650B（08019685）
· 透射電子顯微鏡
FEI Tecnai Spirit（16041491）
· 掃描電子顯微鏡
FEIQuanta 200（08019747）
· 超薄切片機
LeicaEM UC6 （08018130）
· 冷凍超薄切片機
LeicaEM UC7 （15005387）
· 高端數據處理軟體，滿足用戶電鏡數據分析需求提供制樣、切片服務
聯繫方式
光鏡機組：010-62789417-223/191；清華大學醫學科學樓C119/C132
電鏡機組：010-62789417-215/220；清華大學醫學科學樓C117/C132
預約網站：http://yqgx.tsinghua.edu.cn