離子交換層析的原理和應用

2021-02-18 單克隆抗體

原理

離子交換層析的原理簡單來講是基於帶相反電荷分子間的相互吸引。蛋白質表面所帶的電荷取決於其PI和環境PH。構成離子交換劑的基礎介質通常為多孔珠形式，可以為蛋白質的吸附提供足夠大的表面積。固定於基礎介質上的的帶電配基可以帶正電荷也可以帶負電荷。為提高介質的結合容量，可將帶電荷的多聚體取代小分子配基植於介質上。無論電荷配基的分子大小，我們可以將分為陽離子交換劑和陰離子交換劑。陽離子交換劑帶負電荷，而陰離子交換劑帶正電荷。當蛋白質溶液PH值大於目的蛋白PI時，蛋白質帶負電荷，可與陰離子交換劑結合；當蛋白質溶液PH值小於目的蛋白PI時，蛋白質帶正電荷，可與陽離子交換劑結合。離子交換劑本身就相當於酸或鹼，而電荷的歧化反應取決於其PH，強的離子交換劑，本身相當於一種強酸或強鹼，在較寬的PH範圍內，所帶的電荷不會發生改變；但是，若離子交換劑卻會發生改變。

 

離子交換層析的一般操作步驟

1、加載鹽溶液；

2、平衡層析柱；

3、蛋白質上樣；

4、洗去未結合物質；

5、洗脫；

6、再生；

7、消毒處理；

步驟

緩衝液濃度

緩衝液體積

加載鹽溶液

平衡

蛋白質上樣

洗去未結合物質

洗脫

線性梯度

分步梯度

線性PH梯度

手動PH梯度

再生

消毒處理

>=1mol/L

10-100mmol/L

與平衡緩衝液相似

含最終添加物的平衡緩衝液

 

0-500mmol/L鹽

150-500mmol/L鹽

<50mmol/L

<=10mmol/L

1mol/L高濃度鹽

>=1cv

達到10cv

取決於動態結合容量

>=1cv

 

10cv

1cv

 

 

1cv

>=1剩餘時間

 

1、因為平衡離子必須要徹底的飽和帶電荷的配基，所以鹽溶液的加載是至關重要的。此步驟通常採用含有1mol/L NaCl、摩爾濃度10-100mmol/L的緩衝液進行。很少使用KCL，二價離子避免使用。加載緩衝液的體積至少1個柱體積，以確保層析柱飽和。

2、平衡層析柱時，採用緩衝液應適宜於蛋白質結合。依據具體情況確定緩衝液的類型、PH及鹽濃度。平衡緩衝液至少需要10個柱體積，以便獲得更穩定的PH環境。

3、蛋白質溶液上樣時應採用與平衡緩衝液一致的PH和電導率。可採用分子篩層析，透析或滲透對蛋白質溶液進行脫鹽，以達到與緩衝液相同的離子組成，進而獲得相對穩定的上樣條件。

4、完成蛋白質上樣後，洗去未結合的物質。首先採用平衡緩衝液清洗，也可採用多步驟清洗，結合緊密的蛋白質可以採用稍高鹽濃度的平衡緩衝液清洗。

5、洗脫會受到線性或分步鹽梯度的影響，一般先採用線性鹽梯度洗脫，維持梯度約10個柱體積，梯度操作需要兩種緩衝液，平衡緩衝液和用於加載相反電荷離子所用緩衝液，大多數情況下並不需要後半段的梯度，因為多數蛋白質都可以在150-500nmol/L的鹽濃度下從離子交換劑上洗脫下來。

6、層析柱的再生最佳條件是使用最初加載鹽溶液相同的緩衝液。當蛋白質溶液中含有脂類，內毒素、和其他粘性物質時，推薦具有腐蝕性的試劑進行再生，優選1mol/L的NaOH，NaOH的使用濃度取決於固定相的耐受性。一般使用1個柱體積就足夠了，頑固性物質可將層析柱侵泡與NaOH溶液中。

7、NaOH的處理同樣具有消毒作用。它可以減少層析柱中的細菌數量，但層析柱一般不進行滅菌處理。

8、層析柱需要用再生緩衝液仔細清洗後才能儲存，儲存時用相反的電荷離子將層析柱完全飽和。層析柱飽和後用緩衝液進行清洗和儲存，如20%乙醇。

原核蛋白不表達原因匯總

離子交換層析原理

可溶性表達策略及原理

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