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世界衛生組織（WHO）統計顯示，截至3月13日，全球共有41個候選疫苗在研發。另外一組統計數據是，截至3月17日，全球至少有96家公司和學術團體宣布66個新冠病毒疫苗開發計劃[1]。
據國家衛健委醫藥衛生科技發展研究中心介紹，目前國內新冠疫苗攻關工作正沿著5條技術路線推進，即：滅活疫苗、重組亞單位疫苗、腺病毒載體疫苗、減毒流感病毒載體疫苗、核酸疫苗[2]。
本文擬介紹這5種新冠疫苗技術路線的原理、研究進展、特點及其生產工藝。
01
研發中的新冠疫苗
1.滅活疫苗
滅活疫苗是指將病毒經適當的方法進行批量培養並滅活處理之後製備而成的疫苗[3]。病毒滅活疫苗是一種經典的疫苗形式，也是一種易於快速研究和製備的有效疫苗。通常在發生病毒性傳染病時，往往優先選擇針對該病毒的滅活疫苗。
在已經上市的疫苗中，以滅活疫苗居多，例如狂犬病滅活疫苗、流感滅活疫苗、腸道病毒71型滅活疫苗、A型肝炎滅活疫苗等[3][4]。
據報導，國內有多家公司和機構研發新型冠狀病毒的滅活疫苗，見表1。
表1 研發新型冠狀病毒的滅活疫苗的單位
（來源於公開信息）
滅活疫苗的優點是：
（1）相對於減毒活疫苗，安全性好；
（2）相對於亞單位疫苗，具有完整的分子空間結構，抗原成分的空間結構比較接近原始狀態；
（3）相對於減毒活疫苗，易於儲存和運輸。
滅活疫苗的缺點有：
（1）相對於減毒活疫苗，產生免疫力需要長時間；
（2）相對於減毒活疫苗，接種途徑少；
（3）相對於亞單位疫苗，副作用較大；
（4）相對於亞單位疫苗，批間差控制難度稍大。
2.重組亞單位疫苗與多肽疫苗
重組亞單位疫苗主要是通過基因工程表達的蛋白抗原純化後製成的疫苗，以及將抗原組裝成病毒顆粒樣（VLP），從而形成VLP疫苗。基因工程表達的抗原不但可以代替傳統的方法生產抗原，而且還可以用於病原體難於培養或有潛在致癌性，或免疫病理作用的疫苗。
多肽疫苗是按照病原體抗原基因中已知或預測的某段抗原表位的胺基酸序列，通過合成技術製備的疫苗[3]。
隨著生物技術尤其是結構生物學的發展，通過結構改造設計疫苗的報導如雨後春筍般湧現。比如，將病原體的含抗原決定部位的蛋白嫁接到骨架上或者固定成特定目標結構，從而引起機體中和抗體的產生[9][10]。
已經上市的亞單位疫苗產品有重組帶狀皰疹疫苗、基因工程B型肝炎疫苗、基因工程人乳頭瘤疫苗、基因工程戊型肝炎疫苗等[3]。
據報導，國內已經有多家公司和機構啟動新冠病毒重組亞單位疫苗的研究，如中科院微生物研究所、智飛生物、宇之波生物、昭衍生物、神州細胞[7] [11]等。上海在新聞發布會上透露某公司製備的病毒樣顆粒（VLP）疫苗的小鼠免疫實驗已產生特異性抗體[12]。北京康樂衛士將新冠病毒的最有效的抗原成份（表位）基因拿出來，插入到其它病毒的結構蛋白基因中，進行體外重組和融合蛋白表達，製成多肽疫苗，正在動物體內進行測試[13]。
康眾生物採用一種創新的人工合成病毒樣顆粒（Synthetic Virus-like Particles, SVLP）核酸遞送技術，製備重組蛋白疫苗佐劑，模擬病毒的天然結構及自然感染過程，具有快速誘導機體產生極強的體液免疫和細胞免疫應答的優勢。動物實驗結果表明，免疫後7天即可獲得足夠高的S1抗體效價，三周後抗體平均效價達1:600萬以上，實驗動物對疫苗製劑耐受良好[14]。
值得注意的是三葉草生物製藥公司在哺乳動物細胞內成功表達「S-三聚體」新型冠狀病毒重組蛋白疫苗。用新獲得的「S-三聚體」抗原在多例病毒感染患者康復後血清中檢測到病毒特異性抗體。這一結果表明「S-三聚體」重組疫苗保留了新冠病毒S-蛋白抗原天然的結構，因此「S-三聚體」疫苗有望在人體中誘導保護性的免疫反應[15]。
表2 研發新型冠狀病毒重組蛋白疫苗的單位
（來源於公開信息）
亞單位疫苗與多肽疫苗優點是：
（1）產量大、純度高；
（2）副作用小；
（3）安全性高，針對性強；
（4）一定程度上可以避免抗體依賴性增強效應（antibody-dependent enhancement, ADE）。
亞單位疫苗與多肽疫苗缺點有：
（1）成本較高；
（2）依賴佐劑甚至受佐劑制約。
3.載體疫苗
載體疫苗是指利用微生物，如某些細菌和病毒做載體，將保護性抗原重組到微生物中，使用能表達保護性抗原基因的重組微生物製成的疫苗。常見的病毒載體有痘苗病毒、腺病毒、水泡性口炎病毒、甲病毒複製子等[3]。
已經上市的載體疫苗有重組伊波拉病毒疫苗（腺病毒載體）[16]。
由康希諾聯手軍事科學院軍事醫學研究院生物工程研究所研發的重組新型冠狀病毒疫苗(腺病毒載體)已經處於臨床階段[17]。另外，楊森生物、武漢博沃等單位也正在研發病毒載體新冠疫苗[11][18]。
值得關注的是，廈門大學和長春百克生物等單位聯合研發的減毒流感病毒載體新冠疫苗也在研發中，該類疫苗可以通過鼻腔滴注方式接種[19]，如果研製成功有利於提高疫苗接種率。該流感病毒載體疫苗正在進行實驗動物的安全性和有效性研究，預計4月底完成候選疫苗的臨床前研究[20]。
表3 研發新型冠狀病毒載體疫苗的單位
（來源於公開信息）
載體疫苗優點是：
（1）無需佐劑，載體本身可發揮佐劑作用；
（2）誘導體液免疫和細胞免疫，甚至黏膜免疫；
（3）純化簡單；
（4）可以同時表達多個抗原做聯合疫苗。
載體疫苗缺點有：
（1）機體中和抗體中和；
（2）有一定的安全隱患。
4.核酸疫苗
核酸疫苗是將編碼某種抗原蛋白的外源基因(DNA或RNA)直接導入動物體細胞內，並通過宿主細胞的表達系統合成抗原蛋白，誘導機體產生對該抗原蛋白的免疫應答，以達到預防和治療疾病的目的[3]。
核酸疫苗一般分為DNA疫苗和mRNA疫苗兩種。相比前面幾種疫苗，核酸疫苗生產工藝相對簡單[21]，尤其是mRNA疫苗無需細胞培養或動物源基質、合成速度快、成本低。mRNA疫苗發揮作用無需進入細胞核，沒有整合至宿主基因組的風險，且為一過性表達，半衰期可以通過修飾進行調整。因此，mRNA疫苗的發展前景比較明朗[22]。
目前上市的核酸疫苗主要是DNA疫苗，且都為獸用疫苗，如西尼羅病DNA疫苗（馬用）、犬黑色素瘤DNA疫苗[3]；國內有預防H5亞型禽流感的DNA疫苗[23]。值得關注的是很多mRNA疫苗產品已經進入臨床階段。比如，BioNTech針對黑色素瘤個性化腫瘤疫苗在II期臨床，前列腺癌、乳腺癌等的mRNA疫苗在I期臨床中；CureVac針對非小細胞肺癌、黑色素瘤的mRNA疫苗在I期臨床；Moderna針對黑色素瘤的mRNA疫苗已經開展II期臨床；Tuebingen大學針對黑色素瘤的mRNA疫苗已經完成I/II期臨床[22]。
美國生物科技公司Moderna的新冠病毒mRNA試驗性疫苗，跳過動物實驗，直接開始人體試驗[24]。德國CureVac公司日前也已宣布，將儘快且安全地將候選mRNA疫苗推進臨床試驗[25]。
表4 研發新型冠狀病毒核酸疫苗的單位
（來源於公開信息）
核酸疫苗的優點是
（1）工藝簡單、成本低；
（2）無需佐劑；
（3）可對腫瘤疾病發揮作用；
（4）DNA疫苗自帶佐劑功能；
（5）mRNA疫苗研發、生產時間短，易於放大；
（6）mRNA疫苗特別適合突發性傳染病。
核酸疫苗缺點有：
（1）DNA有整合宿主基因組的風險；
（2）RNA容易降解。
（3）mRNA疫苗需要修飾和遞送系統。
此外，還有一些新技術和優勢平臺也在參與或助力新冠病毒疫苗研究。
北京鼎成肽源生物與貝達藥業合作，針對新冠病毒研發的抗新冠病毒通用型細胞疫苗已進入動物實驗階段，預計4月下旬進行臨床研究[26]。
澳大利亞昆士蘭大學正利用一種「分子鉗」技術能夠增加病毒蛋白的穩定性。研究人員嘗試利用該技術開發針對伊波拉病毒、流感病毒等疫苗，已取得非常理想的實驗效果。該校研究團隊目前已獲得新冠病毒的基因序列，正處於研製疫苗的初期階段。
英國葛蘭素史克（GSK）公司將與國際組織「流行病防範創新聯盟」合作，推進新冠病毒疫苗的全球研發。該公司的優勢技術之一，就是對於疫苗生產十分重要的佐劑[24]。
02
新冠疫苗有關的生產工藝
1.病毒類疫苗
病毒類疫苗主要包括減毒活疫苗、滅活疫苗，以及病毒載體疫苗（以病毒為載體的活疫苗），這些類型的疫苗生產工藝類似。相對來說，滅活疫苗主要是多了滅活的步驟，需要更大的生產規模，同時下遊純化也稍微複雜，製劑需要佐劑增強抗原的免疫作用。而減毒活疫苗和病毒載體疫苗生產規模相對較小，下遊純化簡單，一般無需佐劑。
病毒培養歷經動物器官培養、禽胚培養，到現在大部分利用細胞培養，包括原代細胞和傳代細胞。原代細胞無轉化性質，但容易產生批間差，而且容易汙染。傳代細胞批間差異小，有利於大規模培養，但具有轉化性質。現在大部分疫苗採用傳代細胞進行大規模培養。
人用病毒疫苗生產常用的細胞有Vero細胞、人二倍體細胞等，多為貼壁細胞，使用細胞工廠培養或使用微載體在生物反應器中培養，在培養基中添加牛血清的細胞培養方式。
病毒載體疫苗生產常用HEK293細胞來擴增載體病毒，因為部分載體病毒對血清敏感，大多採用無血清培養方式。還有一些製備載體疫苗的病毒載體是使用禽胚進行培養的。
細胞培養製備病毒培養物經過破碎、過濾後稱為病毒原液。對於滅活疫苗在病毒滅活以後需要進一步純化，甚至還需濃縮病毒。然後配製如稀釋或加入佐劑。
圖1. 病毒類疫苗生產工藝示意圖
圖1是病毒類疫苗生產工藝示意，研發中的新冠滅活疫苗和病毒載體疫苗基本都採用類似生產工藝生產，但減毒流感病毒載體新冠疫苗可能例外。
國內流感病毒疫苗採用雞胚病毒擴增的生產工藝，雖然國內已經有MDCK細胞培養工藝的禽用禽流感疫苗上市，但人用流感疫苗還一直使用雞胚生產工藝。國外流感疫苗生產工藝有雞胚擴增病毒擴增工藝，也有細胞培養工藝，包括Vero細胞、MDCK細胞、EB66細胞等。
2.重組蛋白類疫苗
重組蛋白類疫苗主要有重組亞單位疫苗、VLP疫苗等，表達系統有大腸桿菌、酵母、昆蟲細胞、哺乳動物細胞，應根據蛋白抗原的特點選擇表達系統。
大腸桿菌表達會涉及包涵體變性復性，但培養基要求簡單。
酵母菌表達重組蛋白中使用較多的是畢赤酵母、釀酒酵母、漢遜酵母等，培養基要求也不複雜。
昆蟲細胞培養杆狀病毒表達常用的昆蟲細胞有Sf9細胞、Sf21細胞等，採用無血清培養基在生物反應器中培養。
製備重組蛋白疫苗常用的哺乳動物細胞HEK293、CHO等，採用無血清培養基在生物反應器中培養。
表5 不同表達系統的優勢和劣勢
不同表達系統的下遊純化方面差異很大，應該根據表達蛋白特點選擇純化工藝。
圖2. 重組蛋白類疫苗生產工藝示意圖
圖2是重組蛋白類疫苗生產工藝示意，研發中的重組亞單位新冠疫苗和病毒顆粒樣（VLP）疫苗一般採用類似生產工藝生產。
3.核酸類疫苗
核酸類疫苗包括DNA疫苗和mRNA疫苗。
DNA疫苗生產工藝相對簡單，其中工程菌的發酵和純化是影響DNA疫苗產量和生產成本的兩個關鍵環節[21]。
圖3.DNA疫苗生產工藝示意圖
圖3是DNA疫苗生產工藝示意，研發中的DNA新冠疫苗一般採用類似生產工藝生產。
mRNA疫苗產業化容易，速度快，成本低，從基因測序至生產只需要數周的時間，因此在對時間要求比較緊急的疫情中有望發揮重要作用。
圖4. mRNA疫苗生產工藝示意圖
圖4是mRNA疫苗生產工藝示意，研發中的mRNA新冠疫苗一般採用類似生產工藝生產。
面對新冠疫情，全球疫苗公司八仙過海、各顯神通，基於自己公司的平臺研發新冠疫苗。進展較快的是美國Moderna的新冠病毒mRNA疫苗和國內康希諾腺病毒載體疫苗，均已經進入臨床階段[17][24]。但疫苗的研發需要較長的過程。第一個階段是疫苗前期研發過程，包括獲得免疫原、免疫反應測試、動物保護測試、生產工藝優化、臨床前毒理研究等環節；第二個階段是疫苗研發及註冊過程，包括臨床前研究、申報臨床、完成臨床試驗，最後才能實現疫苗上市[27]。
到底哪些疫苗能夠殺出重圍，造福人類，讓我們拭目以待！
（2020年3月29日）
參考資料
[1]https://tech.sina.cn/2020-03-20/detail-iimxyqwa1921329.d.html?vt=4&pos=18
[2]https://www.sohu.com/a/379014480_651392
[3]趙鎧. 疫苗研究與應用[M].人民衛生出版社，2013
[4]https://vaccines.procon.org/view.resource.php?resourceID=005206
[5]https://www.cnbg.com.cn/content/details_12_5017.html
[6]https://baijiahao.baidu.com/s?id=1659282207935481591&wfr=spider&for=pc
[7]http://finance.eastmoney.com/a/202003061408290143.html
[9]Ofek G , Guenaga F J ,Schief W R , et al. Elicitation of structure-specific antibodies by epitopescaffolds[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences of the UnitedStates of America, 2010, 107(42):17880-17887.
[10]Zhang B , Chen L , SilacciC , et al. Protection of calves by a prefusion-stabilized bovine RSV Fvaccine[J]. npj Vaccines, 2017, 2(1):7.
[11]https://zhuanlan.zhihu.com/p/109389993
[12]http://dy.163.com/v2/article/detail/F7SQGCM30537A5Y9.html
[13]https://www.bj-klws.com/html/news/enterprise/158201799602333.html
[17]https://baijiahao.baidu.com/s?id=1661374254295106009&wfr=spider&for=pc
[18]http://zhengce.chinabaogao.com/yiyao/2020/0394RE92020.html
[19]https://www.thepaper.cn/newsDetail_forward_6336769
[20]https://new.qq.com/omn/20200318/20200318A06EFH00.html
[21]陳光明,劉玉華. 核酸疫苗製備工藝研究進展[J]. 生物技術通訊, 2006(06):129-131.
[22]http://finance.ifeng.com/c/7v2p2iv1Bzd
[23]http://hlj.ifeng.com/a/20180531/6618718_0.shtml
[24]http://news.39.net/kyfx/200318/7808983.html
[25]https://c.m.163.com/news/a/F5GNEG6J00018AOQ.html?spss=wap_refluxdl_2018&spssid=57bb9a8658d39b2db9ba6b3ea54bd32a&spsw=1&isFromH5Share=article
[26]https://baijiahao.baidu.com/s?id=1662219513632681831&wfr=spider&for=pc
[27]https://baijiahao.baidu.com/s?id=1658407441041283592&wfr=spider&for=pc
來源：生物咖啡茶