撰文 | 雪月
責編 | 兮
細胞發生飢餓應激時通過蛋白酶體和自噬系統啟動蛋白降解機制，以及同時抑制蛋白翻譯重新配置細胞蛋白質組。其中核糖體是該反應的主要靶標，核糖體負責翻譯並在飢餓應激期間會被溶酶體降解【1】。核糖體蛋白（ribosomal (r)-proteins）的細胞豐度很高，約佔蛋白質組的6％，其中精氨酸和賴氨酸含量較高。這樣的特性會自然而然得出假設，在飢餓應激期間通過自噬途徑，將r-蛋白作為鹼性胺基酸的營養來源。
r-蛋白受翻譯和組裝機制以及蛋白酶體降解調控，而自噬可促進核糖體的更新。此前的研究關於胺基酸飢餓或mTOR抑制對細胞中r-蛋白穩態的調控主要集中於自噬對r-蛋白更新的影響。由於自噬只是核糖體穩態調控的途徑之一，因此尚缺乏關於細胞如何在飢餓應激下調節核糖體豐度的全面研究。而且在急性飢餓應激反應過程中對r-蛋白翻譯和降解機制還知之甚少。在特定條件下，r-蛋白質被用作胺基酸來源的程度尚不清楚。
近日，來自美國哈佛大學J. Wade Harper團隊在Nature上發表了Systematic quantitative analysis of ribosome inventory during nutrient stress的文章。本研究通過一系列定量蛋白組學以及翻譯定量檢測的方法發現在急性飢餓應激條件下，細胞會顯著抑制r蛋白的翻譯，同時發現r蛋白降解主要通過非自噬蛋白酶體途徑，而不是核糖體自噬途徑。
為了揭示在飢餓應激條件下r蛋白水平的調控機制，團隊首先開發了一種定量檢測方法，用於分析r蛋白的豐度、合成、更新和分配，並且適用於細胞群或者單細胞檢測。
核糖體蛋白豐度定量分析框架示意圖
首先第一步作者利用11-plex tandem mass tagging(TMT)-based proteomic定量蛋白組學分析整個細胞蛋白水平在不同條件下的變化情況。作者使用了缺失了自噬重要參與基因（ATG5/7或者RB1CC1）的HEK293 HCT116 293T細胞，給予胺基酸飢餓或者mTOR小分子抑制劑Torin1 處理，之後蛋白質組學定量分析發現自噬cargo蛋白和內質網蛋白水平在上述條件下明顯下降，但是下降依賴於自噬過程。相比80種r蛋白，其中有70種r蛋白水平僅適度下降（4.6-11.6%），並且與自噬無關。
然而這與先前的研究相矛盾，類似的情況下有研究利用Ribo-Keima報告系統觀察到了核糖體自噬的發生。因為r蛋白的豐度受翻譯。降解以及細胞減數分裂的影響。為了同時能夠檢測新合成的r蛋白，作者將Halo cassette與HCT116、293T或者HEK293中內源RPS3和RPL29基因的C末端融合，作者稱Ribo-Halo。這種標記不影響r蛋白的翻譯、豐度變化以及對mTOR信號的反應。作者用流式檢測Tor1處理細胞14小時後發現，細胞的平均螢光強度下降了25%，同時作者發現細胞直徑減少了約10%，即體積減少了25%，這樣能夠保持單個細胞中RPS3和RPL29的密度。
總蛋白組學檢測無法檢測到這些變化。接下來作者先用紅色halo標記細胞一個小時後，洗去游離配體，之後再用綠色halo標記新翻譯的r蛋白。檢測發現隨著細胞分裂，新翻譯的r蛋白逐漸增加比重，16小時後能夠觀察到50%預先存在的r蛋白。用Tor1抑制後，預先存在的r蛋白稀釋減少，新合成的r蛋白也減少，總的減少10-30%，細胞分裂也減少。但是mTOR抑制劑處理後，在缺乏ATG7或RB1CC1的細胞裡沒有觀察到新r蛋白豐度、合成和細胞大小的變化。因此mTOR抑制時，新r蛋白生成減少，先前存在的r蛋白稀釋速度變慢。
接下來作者利用azidohomoalanine(AHA)標記新和成的蛋白質，之後使用TMR炔凝膠內定量或者基於鏈黴素親和樹脂的TMT的純化蛋白組學（AHA-TMT）技術系統分析飢餓應激時r蛋白的合成情況。在mTOR抑制和胺基酸飢餓下，TMR檢測顯示總翻譯量降低了60-70%，AHA-TMT蛋白組學量化了8200多種蛋白翻譯發現，大多數的蛋白翻譯受到抑制，r-蛋白的翻譯抑制超過一半。其中mTOR對r-蛋白的選擇性抑制作用大於胺基酸飢餓。ATG7和RB1CC1缺失的細胞的翻譯抑制程度與野生型細胞相當。因此r-蛋白的翻譯抑制有助於在急性飢餓應激狀態下調控核糖體豐度。細胞在急性應激條件下通過自噬回收胺基酸的能力沒有受到影響。
為了探究整個細胞蛋白組的降解變化，作者用AHA標記細胞1h後分析蛋白質的降解情況。在定量分析的蛋白質組中，作者發現了三種模式：自噬依賴性降解；mTOR抑制後不依賴自噬的蛋白酶體降解；mTOR抑制後自噬不依賴性穩定蛋白。而r-蛋白屬於第二種類型。mTOR抑制後，r-蛋白快速周轉不依賴於自噬途徑。
通過以上分析作者認為處於自噬能力缺乏的飢餓應激狀態下，細胞的反應並沒有明顯的缺陷。因此作者通過Ribo-Keima量化了核糖體自噬。Tor1處理10h後，溶酶體中約3-4%的核糖體被降解，這與以上研究結果一致。作者利用核糖體自噬【2】缺乏的細胞即NUFIP1缺失的293T細胞研究發現在飢餓應激下r蛋白的蛋白豐度依然下降。因此在飢餓應激條件下，核糖體自噬並不需要NUFIP1（Sabatini2018年發表的Science工作，詳見：Science長文丨David Sabatini組關於核糖體自噬的關鍵發現）。
r-蛋白富含鹼性胺基酸以及rRNA，作者想檢測是否特定胺基酸和嘌呤飢餓會導致核糖體自噬。於是作者首先選擇性地對細胞進行了Arg，Lys或Leu飢餓，但是核糖體自噬變化量均小於3.4%，表明鹼性胺基酸的飢餓應激並不能選擇性地促進核糖體自噬。利用6-羥基嘌呤抑制肌酐磷酸和鳥苷磷酸的產生，也並不能誘導核糖體自噬。這些都表明特定的營養飢餓應激也不能誘導核糖體自噬調控r-蛋白豐度。
該研究利用一系列定量研究，探究了在急性飢餓應激條件下，翻譯抑制和非自噬蛋白酶體降解機制對r蛋白豐度的調控作用，以及在蛋白質組重塑中的影響。本研究也發現約10%的內質網蛋白會在胺基酸飢餓10h內通過自噬依賴性降解。鑑於內質網蛋白在飢餓應激狀態下對蛋白質組重塑的重要性與r-蛋白相當，這表明在此種狀態下，例如腫瘤發生背景下【3】，內質網蛋白應該是自噬降解的主要目標分子。
核糖體豐度調控環節
本研究中，作者全面分析飢餓應激條件下r-蛋白豐度調控機制。細胞飢餓應激下，r-蛋白翻譯抑制、稀釋核糖體庫存降低細胞增殖，以及r-蛋白的非自噬蛋白酶體降解參與了r-蛋白豐度關鍵調控和細胞全蛋白組重塑。但是相關泛素連接酶仍然未知，尚需深入研究。