題目：WDR45 contributes to neurodegeneration through regulation of ER homeostasis and neuronal death
期刊：Autophagy
影響因子：11.05
主要技術： CRISPAR-Cas9、WB、IHC、TMT蛋白組學 、PRM蛋白靶向驗證
研究背景
宏自噬是降解受損細胞器和蛋白質聚集體的主要細胞分解代謝過程。在人類中，在自噬的多個步驟中起作用的各種基因的突變可引起廣泛的神經退行性疾病。小鼠WDR45神經元特異性敲除可導致自噬和軸突變性功能障礙，運動協調性差和學習記憶障礙。因此，WDR45的主要功能是調節自噬體的形成，其功能的喪失會導致小鼠行為異常。但WDR45的喪失如何導致BPAN中的神經變性的機制仍不清楚。為了解決這些問題，本文作者構建了WDR45敲除小鼠來模擬BPAN病變的複雜過程，並且利用TMT定量蛋白質組學技術和一系列細胞水平的驗證實驗來闡明BPAN樣病理變化的分子機制。
技術路線
實驗結果
1.WDR45基因敲除小鼠顯示認知障礙
首先作者利用CRISPAR-Cas9技術成功構建了WDR45基因敲除小鼠。
圖1-1 成功構建WDR45基因敲除小鼠
接下來作者利用6月齡野生型小鼠和WDR45基因敲除小鼠進行了一系列的行為學實驗，包括morris水迷宮實驗、8臂迷宮試驗、條件性恐懼實驗、旋轉實驗、三箱社交實驗、Pilocarpine誘發癲癇實驗等。結果表明實驗月齡的WDR45 敲除小鼠在運動協調方面沒有明顯損害的跡象，但是在空間學習和條件記憶方面存在認知障礙。另外，與野生型小鼠相比，KO小鼠表現出明顯地更短的潛伏期和更嚴重的癲癇發作。
圖1-2 行為學實驗，顯示WDR45基因敲除小鼠具有認知障礙
2.WDR45基因敲除小鼠腦內出現神經元丟失
由於BPAN患者成年後表現為神經變性病和帕金森病，因此作者利用免疫組化（IHC）和TUNEL染色等方法檢查了老年小鼠是否有神經變性的跡象。結果表明：WDR45敲除小鼠在老年時在前額葉皮質和黑質中表現出神經元丟失。
圖2 WDR45敲除小鼠在老年時在前額葉皮質和黑質中表現出神經元丟失
3.腦組織定量蛋白質組學分析揭示了內質網（ER）蛋白在基因敲除小鼠腦中的積累
作者設計了3個10標TMT定量蛋白組學實驗，分別研究了5對野生型（WT）小鼠和敲除（KO)小鼠的大腦前額葉皮層（PFC）、海馬（HIP）和中腦（MIB）組織的差異定量蛋白組學。共定量到近4000個蛋白，以FC>1.5，P<0.05的標準，在PFC、HIP和HIP組織中分別篩選到67、12、185個顯著差異蛋白，其中PFC和MIB共有30個顯著差異蛋白，HIP和MIB共有4個顯著差異蛋白。定量結果的主成分分析表明，兩種基因型在不同腦區的蛋白質表達譜是完全分離的。這些結果說明利用質譜定量的方法能夠通過WDR45的缺失來區分小鼠腦組織蛋白質組。
圖3 WT和KO小鼠腦組織蛋白質組定量分析
另外，生信分析結果表明，內質網（ER）蛋白在基因敲除小鼠腦中積累最為顯著，其次是脂質代謝過程和內膜系統組織。
圖4 生物信息學分析顯示內質網（ER）蛋白在WDR45 KO小鼠體內積累
4.WDR45通過蛋白酶體和溶酶體途徑調節靶ER蛋白
接下來，作者研究WDR45如何調節內質網蛋白的水平。首先，Western blot 實驗結果證實WDR45 KO小鼠中腦內源性SEC22B顯著上調，與質譜定量結果趨勢一致。然後，作者在存在或缺乏BAFA1（一種阻止自噬體溶酶體融合的自噬抑制劑）或MG132（一種蛋白酶體抑制劑）的情況下共表達WDR45和4個內質網蛋白，結果表明，BAFA1可有效地阻斷WDR45介導的SEC22B降解，而BAFA1和 MG132均可阻斷WDR45介導的BCAP31降解。而對照組，只有MG132對GFP的穩定性有輕微影響。這些不同的作用結果表明，位於內質網不同部位的蛋白質被不同的機制降解。此外，在細胞中通過shRNA敲低WDR45，與敲低Scrbl 相比，所有四種ER蛋白質在sh-WDR45的細胞都有積累，與KO小鼠腦中觀察到的效果類似。這些結果表明WDR45對內質網蛋白亞群的穩定性有負面影響。
圖5 WDR45介導靶標內質網（ER）蛋白的降解
5.WDR45缺失細胞可導致ER擴增，增加ER應激
隨後，作者研究了ER蛋白的積累是否與ER面積的擴大相關。通過標記內源性ER蛋白CALR（calreticulin），shRNA敲低WDR45與與敲低sh-SCRBL的細胞相比，顯示出明顯的內質網擴張。此外，使用衣黴素誘導內質網應激可導致外源WDR45被聚集到WT的ER中，而在WDR45缺失細胞沒有這種現象。免疫螢光分析結果表明，在內質網應激後，在WT皮質神經元的溶酶體（紅色）中積累了CALR蛋白（綠色），表明內質網蛋白的溶酶體降解需要WDR45。為了驗證內質網自噬的這種作用是否是細胞器特異性，作者用羰基氰化物間氯苯腙（CCCP）處理細胞來破壞線粒體膜電位。對照組細胞經CCCP處理24小時後，PRKN染色明顯減少，線粒體明顯萎縮，提示PRKN介導了細胞的有絲分裂。然而，在敲低表達sh-WDR45的細胞中，線粒體明顯增大。最後，對小鼠黑質的透射電鏡分析顯示KO小鼠內質網小管增大。因此，作者證明了宏自噬的缺陷導致了內質網和線粒體這兩個獨立細胞器的自噬缺陷。
此外，作者發現，誘導內質網應激可進一步促進ER伴侶蛋白HSPA5的表達。在KO小鼠的原代神經元中，作者還發現HSPA5表達增加，ERN1/IRE1激活，XBP1選擇性剪接增加。
圖6 WDR 45缺失細胞表現為ER應激增加，ER面積增加
6.WDR 45缺失導致ER應激後細胞死亡增加
接下來的實驗結果表明，在WDR45缺失的原代神經元中，ER標記的Calr水平升高，自噬受體SQSTM1積累，LC3-II:LC3-I比率降低。作者利用western blot和免疫組化的方法對小鼠腦中以SQSTM1積累為特徵的自噬缺陷和LC3-II：LC3-I水平降低，以HSPA5，DDIT3 / CHOP為特徵的ER應激增加以及ERN1 / IRE1途徑的激活，以及最終增加的細胞凋亡進行了重新描述。內質網應激誘導的細胞凋亡以CASP12的斷裂為特徵，在16個月齡時，作者還發現WDR45 KO小鼠PFC區CASP12的斷裂增加。但在腦組織中UPR通路的激活存在差異。KO小鼠EIF2A磷酸化增加，提示EIF2AK3活化，ERN1/IRE1磷酸化和ATF6（N末端）水平變化不顯著。在1月齡的KO小鼠中沒有觀察到內質網應激、未摺疊蛋白反應和凋亡的缺陷，這與衰老是神經退行性變的一個重要危險因素的觀點一致。
圖7 WDR 45缺失導致ER應激後細胞死亡增加
7.激活自噬或抑制內質網應激挽救細胞凋亡
作者進一步猜想是否可以通過調節自噬和內質網應激水平來實現對細胞凋亡的藥理挽救。作者使用雷帕黴素（mtor信號抑制劑）實驗發現，雷帕黴素誘導自噬可能有助於預防或減輕神經退行性疾病的致病性蛋白聚集。此外，作者還使用了牛磺去氧膽酸（一種內質網應激抑制劑）進行實驗。結果表明，雷帕黴素或牛磺去氧膽酸可減少WDR45缺失細胞中外源表達的ER蛋白SEC22B和SEC61B的積累。加重內質網雷帕黴素或牛磺去氧膽酸可減輕WDR45缺陷細胞的應激。同時雷帕黴素或牛磺去氧膽酸也降低了WDR45缺失細胞CASP3斷裂的增加。流式細胞術標記細胞表面標誌物ANXA5/ANNEXIN V和7-ADD的結果表明，雷帕黴素和牛磺去氧膽酸均可減輕tm誘導的細胞凋亡。最令人興奮的是，在培養的原代神經元中，tm誘導的自噬活性在KO神經元中有缺陷。雷帕黴素和牛磺去氧膽酸可顯著降低KO神經元CASP3的裂解。總之，這些數據提供了WDR45缺失導致自噬缺陷與內質網質量控制之間的完整聯繫；並提示β-螺旋槳蛋白相關神經變性病的潛在機制。
圖8 激活自噬或抑制UPR可挽救異常蛋白質加工並增加WDR45缺失細胞的細胞死亡
小結
該研究利用CRISPAR-Cas9構建了WDR45 基因敲除小鼠，然後利用RT-PCR、PRM分別從基因水平和蛋白水平驗證WDR45的敲除效果。一系列動物行為學實驗，包括morris水迷宮實驗、8臂迷宮試驗、條件性恐懼實驗、旋轉實驗等結果顯示WDR45基因敲除小鼠具有認知障礙。然後作者利用3 x 10標TMT實驗從分子層面研究了小鼠大腦組織的定量蛋白質組學，發現在基因敲除小鼠中的積累了大量的內質網（ER）蛋白。而後作者從細胞水平上驗證發現WDR45缺乏可引起內質網蛋白積累，從而導致內質網應激增加和內質網質量控制受損。未摺疊蛋白反應通過ERN1/IRE1或EIF2AK3/PERK途徑升高，最終導致神經元凋亡。通過MTOR抑制內質網應激或激活自噬可減少細胞死亡。因此，WDR45的缺失會削弱神經元的宏自噬機制，並導致細胞器自噬的損傷，提供了對BPAN病因的機制性理解和治療這種遺傳性疾病的潛在治療策略。