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2019年6月10日/醫麥客 eMedClub/--近日，美國博德研究所張鋒在Science 在線發表了題為「RNA-guided DNA insertion with CRISPR-associated transposases」的研究論文。該研究表徵了來自藍細菌Scytonema hofmanni的CRISPR相關轉座酶（CAST），實現了新型高效的DNA定向插入。
ShCAST由Tn7樣轉座酶亞基和V-K CRISPR效應物（Cas12k）組成。在研究中，ShCAST在PAM位點下遊60-66bp處定向插入DNA片段，而且該過程是RNA指導的DNA轉座。 研究結果顯示，ShCAST將DNA整合到大腸桿菌基因組中的特定位點，編輯效率高達80％，無需正選擇。
▲ RNA指導的DNA轉座模型
總之，這項工作反映了CRISPR-Cas系統超出適應性免疫的功能，同時該功能不依賴Cas核酸酶活性，並且在不涉及同源重組途徑的前提下提供了靶向插入DNA的策略。
可以說，這項工作擴展了對CRISPR-Cas系統功能多樣性的理解，並實現和建立了精確DNA插入，顯示出了在真核細胞中令人興奮的基因組編輯潛力。
資本在基因手術刀上跳舞
得益於這一消息，張鋒等人的Editas Medicine公司股票股價迅速拉升。
▲ Editas股票走勢
而大家肯定沒有忘記，2018年6月，《Nature Medicine》期刊上發表的兩篇論文引起了業內熱議，來自知名科研機構瑞典卡洛林斯卡研究所與劍橋諾華生物醫學研究院的兩個獨立團隊發現：經過基因編輯成功改造的細胞很可能會成為潛在的癌細胞！
文章研究結果顯示，如果抑癌基因p53存在且功能健全，那麼CRISPR能夠激活p53引發DNA損傷而使細胞死亡，致使基因編輯失敗；而成功編輯的存活細胞大多是p53通路功能存在障礙的，存在癌變的風險。也就是說，癌變或者基因編輯失敗？
一時間，開發CRIPSR技術的幾個公司的股票都下滑了10%左右。
到此，聯繫以上兩篇論文。CRISPR/Cas9和p53的相遇似乎是一段孽緣，似乎只能在失敗和癌變中選擇其一。
但許多行業專家們指出，這絕非CRISPR基因編輯技術的末日。首先，我們尚未在小鼠實驗中看到由於CRISPR基因編輯導致的腫瘤爆發，因此這兩篇論文的發現可能在臨床上的負面影響有限。此外，這一風險並不是無法解決的。
2018年7月，CRISPR-Cas9基因編輯技術再引爭議。發表在《Nature Biotechnology》上的一項研究表明，CRISPR-Cas9技術可能導致廣泛的突變和遺傳損傷，其對基因組的造成的影響可能被「嚴重低估」。
在這項研究中，英國威康桑格研究所教授布拉德利領導的課題組首先檢驗了CRISPR系統在小鼠的胚胎幹細胞中，對一條特定基因的編輯能力。和之前我們對CRISPR基因編輯的認知類似，靶向外顯子的gRNA取得了非常好的基因敲除效果，效率達59%-97%。
他們意外地發現，靶向內含子的gRNA，基因敲除的效率也不低。其中，離外顯子序列較近的一些gRNA，其基因編輯效率也能達到8%-20%。更誇張的是，有兩條gRNA靶向的內含子序列，距離最近的外顯子有2kb的距離，它們竟也有5%-7%的編輯效率，明顯高於負對照。後續的測序結果則發現，儘管這些gRNA靶向的是較遠的內含子區域，但該基因的外顯子依舊會被刪除。
總之，該研究表明，經過CRISPR-Cas9系統編輯後出現了大量的DNA鹼基的刪除或插入變異，而且其中一些基因與初始編輯點並不相近。
這會導致巨大的影響，例如一些不正常的缺失會沉默那些本來應該活躍的基因，或者激活一些本來應該被關閉的基因（如致癌基因）。這一效應在小鼠的胚胎幹細胞、小鼠的造血祖細胞和人源的分化細胞系中，都得到了類似的結果。
這個新聞顯然不是基因編輯公司想要聽到的消息，特別是在先前的癌症風險警告推動其股價走低之後。在這份報告公布後，各大CRISPR公司的股價虧損還在繼續，Editas 下跌了5％，CRISPR Therapeutics下跌7％，Intellia下跌了7％。
處在風口之一的Intellia公司很快就反擊了這份報告。該生物技術公司表示，就該報告而言，任何內容都不是新的或特別令人擔憂的。這些缺失並不是新發現的，它不太可能只在CRISPR /Cas9技術上發現，也不會顯著影響基於CRISPR的療法的前進道路。
Intellia首席創新官遺傳學家Tom Barnes說：「目前，Intellia已經分析了編輯目標和數萬個DNA鹼基附近的附帶損傷，但所有的我們已經介紹過的編輯中還沒有看到這些細胞有任何的致癌轉化。」
臨床研究在探索中前進
Editas由張鋒和Jennifer Doudna創立於2013年11月。2018年11月，領先的基因編輯公司Editas Medicine宣布，FDA已接受公司關於EDIT-101藥物的IND申請。這是全球第一個在體CRISPR基因組編輯藥物用於治療第10類萊伯氏先天性黑朦疾病。
▲ EDIT-101原理圖
（圖片來源：editas medicine）
EDIT-101是Editas和艾爾建（Allergan）公司合作開發的基於CRISPR基因編輯技術的在研療法。本質是裝載有CRISPR-Cas9蛋白及兩個sgRNA的AAV病毒。通過視網膜下注射直接注射到患者感光細胞附近，將基因編輯系統遞送到感光細胞中。當感光細胞表達基因編輯系統時，gRNA指導的基因編輯可以消除或逆轉CEP290基因上致病的IVS26突變，從而改善感光細胞功能，為患者帶來臨床益處。適用於CEP290 (c.2991+1655A> G) 內含子雙等位基因突變的萊伯氏先天性黑朦10型（LCA10）患者。
▲ Editas Medicine執行長Katrine Bosley
（圖片來源：usatoday.com）
而基於CRISPR進行的臨床試驗，盤點如下：
醫麥猛爆料
大突破-Zolgensma®獲批 | ASCO | 地西他濱聯合PD-1 | 中國最大License-in | 日本CAR-T療法獲批上市 | 一天製造CAR-T細胞 | CRISPR美國首次人體試驗 |TAC療法橫空出世 | 美國CAR-T治療納入醫保 | 升級版PD-L1/TGF-β雙抗 | PD-1：K藥、O藥、T藥、B藥、I藥 | 中國首個異基因幹細胞產品獲批 |
醫麥乾貨集
19家頂級CAR-T公司PPT(上) | (下) | 20篇腫瘤免疫高引綜述 | 40篇細胞/基因治療人氣文獻 | 30+篇細分領域深度報告 | 70篇精選誠意大禮包 | 女王專屬大禮包 | 硬核CAR-T大禮包 | 硬核腫瘤免疫大禮包 | 基因治療「錦鯉」大禮包 |
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