研究發現:CRISPR可能導致大量重複片段插入基因組 且無法被PCR等...

2020-12-25 前瞻網

研究發現：CRISPR可能導致大量重複片段插入基因組 且無法被PCR等標準方法識別

 Evelyn Zhang • 2020-02-21 19:48:18　來源：前瞻網　E2972G0

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在基因編輯技術被越來越多人所了解的當下，這一領域的突破性研究與進展往往讓科學家們如獲至寶。

近日，一個研究團隊在國際知名期刊《科學進展》（Science Advances）上發表了論文，論文中研究的結果顯示：使用CRISPR對小鼠進行基因敲入時，DNA序列中會出現大量重複片段，且無法被PCR等常規方法檢測出。

CRISPR-Cas9介導的同源性指導的DNA修復是在包括小鼠和人類在內的多種模式生物中進行精確基因編輯的一種選擇方法，已被世界各地用於實驗動物和細胞研究，還已經在臨床試驗中用於治療患者。生物醫學界的廣泛使用改進了該方法，使其更加高效且具有序列特異性。但是，迅速發展的技術仍然存在「陷阱」，研究人員一直在努力通過改善該方法，希望將不良影響最小化。

在生成六個不同的條件基因敲除小鼠模型的過程中，研究人員們發現頻繁（有時僅是同源性）指導的修復和/或非同源末端連接機制導致供體DNA模板多次從頭到尾插入。令人不安的是，在大多數情況下，常規應用的PCR分析未能識別出這些多重整合事件，從而導致大量誤稱精確編輯的等位基因。

於是他們懷疑，這種複製在親本小鼠及其後代中可能很普遍，而通常用於分析此類構建體的標準PCR形式卻忽略了它們。他們還告誡，對修飾的等位基因進行全面分析是必不可少的，並提供切實可行的解決方案，以正確識別精確編輯的染色體。

最後，撰寫論文的德國研究團隊出於課題需要，決定將編碼鈣結合蛋白的S100A8基因通過CRISPR技術插入小鼠體內，以替換原始基因。

上圖為S100A8靶向基因機制的PCR分析

在對這些基因編輯小鼠的50多隻自然繁殖後代的測序中，研究人員發現，使用經過特別設計、能擴增重複序列的特殊PCR ，能夠檢測出其中30多隻小鼠攜帶大量插入片段的重複序列；而普通的標準PCR只能在50多隻小鼠中檢測到2隻存在這樣的重複序列。

上圖為S100A8基因靶向策略的示意圖

S100A8的側翼是指導特定酶切除該基因的特定序列。一旦這些小鼠與僅在靶標組織中表達酶的其他轉基因動物雜交，將導致基因在特定組織中的敲除。

研究者認為，「常規PCR方法無法識別這一現象」，如果不使用專門針對重複序列檢測的PCR，研究人員可能無法意識到模型動物的基因組中會隱藏不必要的突變。而對於產生條件基因敲除小鼠模型的研究人員而言，重複實驗可能導致蛋白質在所有組織中被有效敲除或產生其他不良影響，這往往會損害人們對基因的功能研究。

研究人員們於是建議道，研究人員在使用CRISPR進行敲入時，利用特殊形式的PCR分析，Southern印跡法或能夠分析重複序列的全基因組測序新方法進行分析，了解是否正確編輯了基因組。

「我們需要明確的是，CRISPR-Cas9是一種用於基因刪除和理解生物學的強大方法，」諾丁漢大學的分子生物學家Ed Bolt表示，「但是想要搞清楚用CRISPR-Cas9插入DNA或敲入基因的原理，我們還差得很遠。」

參考來源：https://advances.sciencemag.org/content/6/7/eaax2941

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