海棠酵素:具有改善腸道菌群等益生功能

2020-12-26 對話酵素

海棠酵素

海棠酵素作為人們喜愛的水果類酵素，含有多糖、有機酸、短鏈脂肪酸、胺基酸、生物活性肽、生物酶、多酚、黃酮等生物活性物質，賦予酵素多種功能，具有生津止渴、健脾止瀉的作用，治療消化不良、食積腹脹、增強對疾病的抵抗力等功能，目前對海棠酵素的研究主要在發酵條件和生產工藝的優化方面。

酵素作為一款新型的發酵食品，眾多酵素產品的功能特性、發酵過程的控制尚不清楚。目前，對其發酵理論研究、生產工藝研究和功能作用機制的研究也較少。一方面，由於目前多數酵素產品採用自然發酵，其生產工藝和發酵菌種容易受到環境條件的影響，導致產品的品質和質量不穩定，因此對酵素髮酵過程中微生物菌相的分析及對發酵微生物的了解就顯得非常重要。目前，關於海棠酵素中微生物菌相的研究還尚未相關報導，本研究採用高通量測序技術，對海棠酵素髮酵過程中的微生物菌相構成進行分析；同時採用傳統微生物培養法分離、純化海棠酵素髮酵的優勢微生物菌種，了解其發酵過程優勢微生物，並獲得純培養物，為海棠酵素的接種發酵提供理論基礎和菌種資源；最後，通過小鼠動物實驗，研究海棠酵素對小鼠腸道菌群的影響，為揭示海棠酵素的益生功能奠定理論基礎。

01

材料與方法

材料與試劑

材料：海棠酵素

試劑：革蘭氏染色試劑盒，無水乙醇（分析純）。

培養基：溴甲酚綠（bromocresol green,BCG）牛乳培養基；溴甲酚紫顯色培養基；酵母浸出粉腖葡萄糖（yeast extract peptone dextrose,YPD）培養基。

儀器與設備

HVA-85型全自動高壓蒸汽滅菌器，Multiskan GO型酶標儀，YS100生物顯微鏡，HFsafe 900型超淨工作檯。

實驗方法

海棠酵素活菌數分析及菌株分離：將海棠酵素搖晃均勻，吸取500μL到裝有4.5mL無菌生理鹽水的試管中，按10倍系列梯度稀釋至10-6，分別取稀釋度為10-3、10-4、10-5的稀釋液100μL分別塗布於BCG牛乳培養基（用於乳酸菌的分離）、YPD培養基（用於酵母菌的分離）、溴甲酚紫顯色培養基（用於醋酸菌的分離）中，作3次平行試驗。將BCG牛乳培養基置於37℃條件下培養1～2d，將YPD培養基置於30℃條件下培養2～3d，將溴甲酚紫顯色培養基置於28℃條件下培養2～3d，觀察菌落形態並計數。挑選單個菌落進行顯微鏡觀察，同時記錄菌體的形態特徵。將純化後的菌株採用甘油-80℃保藏並編號。

分離菌株的分子生物學鑑定：採用細菌16SrDNA通用引物對細菌的16SrDNA序列進行PCR擴增。採用真菌18SrDNA對真菌的18SrDNA序列進行PCR擴增。通過2%瓊脂糖凝膠電泳對PCR擴增產物進行分析，將PCR擴增產物純化後委託蘇州GENEWIZ公司進行測序。將測序結果提交至美國國立生物技術信息中心的Gen Bank資料庫中進行基本局部比對搜索工具（basic local alignment search tool,BLAST），選取同源性較高的模式菌株的16SrDNA或18SrDNA序列，採MEGA7.0.14軟體中的鄰接（neighbor-joining,NJ）法構建系統發育樹。

海棠酵素髮酵過程中微生物菌相變化分析：當海棠酵素髮酵至0d、4d、13d、20d、25d、31d時取樣，委託蘇州金唯智生物科技有限公司進行高通量測序，研究海棠酵素髮酵過程中菌相變化情況。海棠酵素的操作分類單元種類分析：OTU數量可以代表物種的豐度，將分析得到的序列按照相似性進行歸類，將序列相似度>97%的序列定義為一個OTU。海棠酵素細菌和真菌菌群結構分析：通過R語言統計和分析作圖，可得各樣本在不同分類水平下含量較高的前30種微生物菌相的相對豐度圖，展示海棠酵素微生物群落組成的種類和相對含量。海棠酵素菌相的a多樣性分析：主要包括超1(Chao1）指數、ACE指數、香農（Shannon）指數、辛普森（Simpson）指數和Coverage指數，其中Chao1指數和ACE指數為菌群豐度指數；Shannon指數和Simpson指數為菌群多樣性指數；Coverage指數代表樣本的測序深度，是指各樣本文庫的覆蓋率，其數值越高則樣本中序列沒有被測出的概率越低。

海棠酵素改善小鼠腸道菌群功能探究：小鼠糞便的收集，選取6周齡雄性昆明小鼠16隻，隨機分為空白組和實驗組，每組8隻。空白組小鼠灌胃0.86%生理鹽水，實驗組小鼠灌胃海棠酵素原液，每天灌胃一次，灌胃0.4mL，連續灌胃28d。取空白組灌胃28d後和實驗組小鼠灌胃0d和28d後的3組小鼠糞便，依次命名為K組（空白組）、G組（灌胃前組）、S組（實驗組）委託谷禾健康生物科技公司進行小鼠腸道菌群分析。採用俞贇霞等的方法，對3組小鼠糞便進行高通量測序，分析不同分類水平上微生物組成差異及變化情況和微生物多樣性，研究海棠酵素改善小鼠腸道菌群的能力。

02

結果與分析

海棠酵素中微生物組成及含量分析

海棠酵素中活菌統計結果見表1。由表1可知，海棠酵素中乳酸菌、醋酸菌、酵母菌含量分別為（4.4±0.1）×107CFU/mL、（5.4±0.1）×108CFU/mL和（5.0±0.2）×105CFU/mL。

表1 海棠酵素中微生物含量

海棠酵素中微生物的分離及鑑定

通過傳統分離培養法從海棠酵素產品中共分離純化出9株菌株，其編號及形態見表2，系統發育樹見圖1。

表2 海棠酵素中分離菌株的菌落及細胞形態

圖1 分離細菌（a）及真菌（b）的系統發育樹

海棠酵素微生物菌相分析

海棠酵素髮酵過程中微生物菌相豐富度分析：海棠酵素髮酵過程中（0～31 d）微生物菌相豐富度分析結果見表3。

表3 海棠酵素髮酵過程中微生物豐富度變化

海棠酵素髮酵過程中微生物組成分析：海棠酵素髮酵過程中（0～31d）細菌菌群的組成見圖2。

圖2 基於門（a）、綱（b）、目（c）、科（d）及屬（e）水平海棠酵素髮酵過程中細菌的相對豐度

海棠酵素髮酵過程中（0～31 d）真菌菌群的組成見圖3。

海棠酵素髮酵過程中微生物菌相a多樣性分析：海棠酵素髮酵過程中微生物a多樣性分析結果見表4。

表4 海棠酵素髮酵過程中細菌和真菌的α多樣性分析

海棠酵素改善小鼠腸道菌群功能

小鼠糞便細菌微生物豐富度分析：對空白組、灌胃前組和實驗組3組小鼠糞便樣品的微生物菌相構成進行比較並繪製韋恩（Venn）圖見圖4。由圖4可知，3組小鼠糞便的總OTU數量和特有OTU數量均為S組>G組>K組，總OTU數量分別為1235、977和834，特有OTU數量分別為461、200和97。結果表明，實驗組的小鼠糞便中細菌物種豐度高於灌胃前組和空白組。

圖4 小鼠糞便樣品中操作分類單元（OTU）的Venn

小鼠糞便細菌微生物組成：基於科、屬水平，空白組、灌胃前組和實驗組3組小鼠糞便細菌微生物組成見圖5。

圖5 基於科（a）、屬（b）水平小鼠腸道細菌物種的相對豐度

小鼠糞便細菌微生物多樣性分析：通過a多樣性分析，3組小鼠糞便樣品的微生物多樣性結果見圖6。由圖6可知，空白組、灌胃前組和實驗組的Shannon指數差別不大，表明三組小鼠的微生物多樣性差異較小。實驗組Chao1指數高於灌胃前組和空白組，表明實驗組小鼠與灌胃前組、空白組相比微生物的豐富度更高。

圖6 小鼠糞便樣品微生物α多樣性分析結果

03

結論

首次對傳統自然發酵法製備的海棠酵素進行微生物菌相分析及功能研究。海棠酵素主要由乳酸菌[（4.4±0.1）×107CFU/mL]、醋酸菌[（5.4±0.1×108)CFU/m L]和酵母菌[（5.0±0.2）×105CFU/m L]組成，經傳統微生物培養法分離鑑定得到9株優勢菌株，其中4株乳酸菌、2株醋酸菌和3株酵母菌。經高通量測序分析可知，海棠酵素在發酵過程中，發酵0～4d，細菌主要為乳桿菌屬（Lactobacillus）、酒球菌屬（Oenococcus）、消化鏈球菌屬（Peptostreptococcaceae）、魏斯氏菌屬（Weissella），發酵13～31d，主要為乳桿菌屬、酒球菌屬；發酵0～31d，真菌主要為酵母屬（Saccharomyces）和假絲酵母屬（Candida）。經a多樣性分析可知，海棠酵素細菌豐富度較高，真菌多樣性較高。動物實驗結果表明，連續灌胃小鼠0.4mL海棠酵素28d後，與空白組和灌胃前組小鼠糞便相比，實驗組小鼠糞便增加了乳桿菌屬和瘤胃球菌屬，減少了枸櫞酸桿菌屬，具有改善小鼠腸道菌群的能力。

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