螢光蛋白的選擇指南

生物學實驗中經常需要用到各種螢光標記，其中最常見的就是螢光蛋白（fluorescent proteins （FPs））。選擇一個成功的螢光蛋白標籤，需要遵循以下原則：首先，所選螢光蛋白能夠高效表達，並且具有較高的螢光強度，以避免細胞自發螢光的幹擾；第二，所選螢光蛋白應具有足夠的光穩定性；第三，考慮所選螢光蛋白是否能形成二聚或多聚體，及其寡聚化對實驗結果的影響；第四，所選螢光蛋白最好對會造成實驗誤差的環境因素不敏感；第五，在需要多種螢光蛋白的標記實驗中，應儘量避免它們之間激發發射光譜範圍重疊造成的幹擾(Shaner et al., 2005)。本文總結了一些選擇實驗最佳螢光蛋白的基本法則，但在具體的實驗過程中還需根據自身實驗要求，選擇實際使用效果最佳的螢光蛋白。

 

螢光強度（brightness）

實際檢測到的螢光蛋白的螢光強度由多種因素決定，包括蛋白內在的螢光強度性質（由其成熟速度和效率（maturation speed and efficiency），消光係數（extinctioncoefficient），量子產率（quantum yield）以及在長時間實驗中的光穩定性（photostability）決定），成像系統的光學性能（包括照明波長和強度（illumination wavelength and intensity），以及濾光片和二向色鏡的光譜範圍（spectra of filters and dichroic mirrors）），和照相機或者人眼對發射光譜（emission spectrum）的敏感程度等。由於這些因素存在，很難定義某種螢光蛋白是否為亮度最強，但我們可以確定特定種類中的亮度最強的螢光蛋白（Table 1，Box 1）(Shaner et al., 2005)。此外溫度等因素對螢光蛋白的摺疊效率會產生影響，比如對於青色螢光蛋白CyPet而言，室溫條件相比於37℃更有利於該蛋白的摺疊(Shaner et al., 2005)。

Table 1 最佳螢光蛋白變體的性質(Shaner et al., 2005)

Box 1 不同種類螢光蛋白的推薦(Shaner et al., 2005)

光穩定性（photostability）

所有螢光蛋白在長時間激發狀態下，最終都會發生光漂白（photobleach），因此在需要對同一視野長時間多次拍攝的應用場景中，選擇光穩定性最好的螢光蛋白非常重要。Shaner等純化了多種螢光蛋白，利用弧光燈（arc lamp）為激發光源測試了它們的光穩定性（Table 1），他們推薦其中的單體螢光蛋白mCherry和mKO為螢光亮度較強，37℃蛋白摺疊效率較高，而且光穩定性較好的兩個螢光蛋白(Shaneret al., 2005)。除了螢光蛋白自身性質，其他因素例如激發光源的強度，也會對螢光蛋白的光穩定性產生影響，比如CFP變體Cerulean的光穩定性在雷射照射下比ECFP強，而在弧光燈照射下比ECFP弱(Shaneret al., 2005)。

 

寡聚化（Oligomerization）

許多野生的螢光蛋白能夠寡聚化，自發形成二聚體或者多聚體。大多數水母源的螢光蛋白（Aequorea-derived fluorescent proteins （AFPs））通常能形成弱二聚體，而引進A206K突變，能夠抑制其二聚體形成(Zacharias et al., 2002)。事實上，螢光蛋白的寡聚能力對所連接的目的蛋白的定位和行為都可能產生影響。例如NRC41-29-YFP在菸草細胞中表達時，能夠引發細胞死亡，且產生具有細胞質膜定位的點狀結構，而NRC41-29-YFPA206K幾乎不形成這種點狀結構（Figure 1），且其引發細胞死亡的能力被削弱(Adachi et al., 2019)。

Figure 1 NRC41-29-YFP能形成 YFP依賴的點狀結構。(A) YFP，NRC41-29-YFP及突變體在本生菸草表皮細胞中的亞細胞定位。RFP-Rem1.3是細胞質膜定位的標誌蛋白。(B) NRC41-29-YFP點狀結構的單張平面圖。白色虛線標識了液泡膜的位置，白色三角標識了NRC41-29-YFP點狀結構。(Adachi et al., 2019)

 

對環境因素敏感度（environmental sensitivity）

大多數螢光蛋白都對酸性環境敏感，對於一般的實驗，列在Table1中的螢光蛋白對酸性環境有足夠的抵抗力，能夠有效工作。當靶向酸性環境（例如溶酶體內腔或者分泌顆粒）時，更多對酸敏感的螢光蛋白使用效果不佳，若有刺激導致環境pH值改變，會造成對螢光定量結果的錯誤估計和評判。在可能會受到酸淬滅（acid quenching）影響的實驗中，應避免使用mOrange，GFPs 和 YFPs。相反，利用這些螢光蛋白對pH的敏感度，可以監測細胞器腔內pH或者胞吐作用（exocytosis）。(Shaner et al., 2005)

 

多螢光標記實驗（multiple labeling）

Shaner等推薦了一個能夠在最小的互相干擾下，同時檢測青色，黃色，橙色和紅色螢光蛋白的濾光片設置（Table 2）(Shaner et al., 2005)。Valm等利用多種螢光蛋白標記了六種具有膜結構的細胞器，包括內質網、高爾基體、溶酶體、過氧化物酶體、線粒體和脂滴，系統地研究了細胞器的相互作用組學，同時給多螢光標記實驗做了一個很好的示範（Figure 2）(Valm et al., 2017)。

 

Table 2 推薦使用的濾光片設置

Figure 2 六色活細胞共聚焦顯微鏡拍攝圖(Valm et al., 2017)

 Adachi, H.,Contreras, M.P., Harant, A., Wu, C.H., Derevnina, L., Sakai, T., Duggan, C.,Moratto, E., Bozkurt, T.O., Maqbool, A., et al. (2019). An N-terminal motif inNLR immune receptors is functionally conserved across distantly related plantspecies. Elife 8.

Shaner, N.C., Steinbach, P.A., and Tsien, R.Y. (2005). A guide tochoosing fluorescent proteins. Nat Methods 2:905-909.

Valm, A.M., Cohen, S., Legant, W.R., Melunis, J., Hershberg, U.,Wait, E., Cohen, A.R., Davidson, M.W., Betzig, E., and Lippincott-Schwartz, J.(2017). Applying systems-level spectral imaging and analysis to reveal theorganelle interactome. Nature 546:162-167.

Zacharias, D.A., Violin, J.D., Newton, A.C., and Tsien, R.Y. (2002).Partitioning of lipid-modified monomeric GFPs into membrane microdomains oflive cells. Science 296:913-916.