近日，北京大學物理學院施可彬研究員和分子醫學所陳良怡教授等人合作將三維無標記光學衍射層析顯微成像與二維海森結構光超分辨螢光成像技術相結合，發展了超分辨螢光輔助衍射層析（SR-FACT）雙模態顯微成像技術，實現了對細胞內細胞器相互作用過程的高速三維全景成像。其中，光學衍射層析成像模態首次實現了活細胞內線粒體、脂滴、核膜、染色體、內質網及溶酶體等多種亞細胞結構的同時高速三維成像。在雙模態系統對活細胞的觀察中，他們發現了一種新的亞細胞結構，命名為「黑色液泡小體」，並對其在細胞代謝過程中的作用進行了研究。這一雙模態成像方法在細胞生物學研究及生物醫學成像領域有著廣泛應用前景。相關成果以「Super-resolution fluorescence-assisted diffraction computational tomography reveals the three-dimensional landscape of the cellular organelle interactome」在線發表在國際光學頂尖光學期刊《Light: Science & Applications》上。論文第一作者是北京大學博士後董大山，博士後黃小帥和博士研究生李柳菊，通訊作者為陳良怡教授和施可彬研究員。
超分辨螢光成像技術的出現極大的推動了現代生命科學對細胞內新結構和新的動態過程的研究。然而，受限於較寬的發射光譜及光毒性，其僅能對有限幾種螢光標記同時成像，難以用於細胞內不同細胞器間複雜代謝過程的研究。電子顯微鏡雖然具有更全面及高解析度的成像能力，但不能對活細胞進行動態成像。即使在活細胞的超分辨螢光成像中，依然也需面對螢光漂白效應對三維成像速度、成像總時程的限制。
無標記成像則不受螢光標記物引入的各種限制。無標記成像技術通過細胞內不同結構表現出的不同光學屬性來進行成像，如以相襯顯微鏡為代表的各種相位成像方法可成像具有不同折射率的結構。新近出現的光學衍射層析成像通過結合斷層掃描及全息顯微成像技術，可在衍射模型下實現三維無標記成像。但先前的工作在關注提高光學衍射層析成像解析度的同時，忽略了較慢的成像速度在活細胞成像中造成的解析度下降的問題。同時，由於缺乏分子特異性成像模態作為對照，其三維成像結果缺乏說服力。
因此，亟需將無標記的光學衍射層析成像模態與超分辨螢光成像模態相結合用於活細胞成像，以同時實現細胞內全景的分子特異性成像。同時還需考慮到兩個模態各自的特點，最大程度的提高成像速度，以適應快速、長時程成像的需求。
在這項研究中，研究團隊集成了三維光學衍射層析顯微成像模態與海森二維結構光照明螢光成像模態，實現了對活細胞的快速、長時程雙模態成像。在三維光學衍射層析成像模態中，研究團隊發展了新的波矢迭代算法以修正高速的照明光斷層掃描中出現的誤差，以在保證高速成像的同時保持成像系統中充足的光子通量，從而有效提高了高速成像過程中的靈敏度，可以200nm橫向解析度對40×40×20 ?m3的三維視場以0.8Hz速度成像。而對於超分辨螢光成像模態，研究團隊選擇了相比傳統結構光照明螢光顯微鏡更加節約光子數的海森二維結構光螢光顯微鏡來輔助光學衍射層析模態進行分子特異性表徵，其橫向解析度可達100nm。利用這一雙模態成像系統，研究團隊成功對活細胞內六種主要細胞器進行了共定位成像，並展示了其在研究細胞器相互作用中的獨特優勢。研究團隊還觀察到了一種新的中性酸鹼度的低折射率囊泡結構，並通過長達小時量級的連續成像揭示了其生成和命運路徑及組織細胞器相互作用的樞紐功能，命名為「黑色液泡小體」。
研究團隊發展的這一雙模態成像方法為全面三維的表徵活細胞內細胞器相互作用及分子或信息的傳遞過程提供了一個有力工具。其有助於發現在單一成像模態中被忽略的結構或動態。由於低光毒性和無需特異標記的特點，這種成像方法未來將在生物學及醫學中發揮重要作用。
圖1. SR-FACT雙模態成像系統的硬體實現、算法流程及解析度表徵。
（a）SR-FACT硬體系統簡圖。光學衍射層析使用環狀斷層掃描，顯微圖像通過與參考光幹涉形成離軸全息圖測量。螢光成像模態通過形成具有特定方向條紋的結構光場激發螢光成像。
（b）光學衍射層析（ODT）模態重構算法流程。不同照明角度下的全息圖像經過全息解算、波矢量迭代優化後通過Rytov近似在三維頻譜空間拼接，逆濾波後得到三維折射率分布。
（c）結構光照明顯微成像（SIM）模態重構算法流程。不同結構光照明角度下的螢光圖像經過參數計算、頻譜分離及二維頻譜拼接後，通過海森解卷積算法得到超解析度螢光圖像。
（d）使用LifeAct-EGFP標記的COS-7細胞在SR-FACT下的成像結果。左側為海森超分辨結構光照明螢光圖像，中間為光學衍射層析成像的折射率分布，右側為雙模態融合圖像。比例尺：5 μm。
（e）光學衍射層析模態及海森結構光照明螢光顯微模態下沿著（d）中肌動蛋白纖維上的折射率和螢光強度分布。
（f）光學衍射層析模態及海森結構光照明螢光顯微模態的橫向解析度評估結果。
圖2. COS-7細胞分裂過程的無標記光學衍射層析三維成像結果（視頻）。
圖3. 六種細胞器在SR-FACT下的共定位成像結果。
（a）KDEL-EGFP標記的內質網的共定位成像結果。
（b）MitoTracker Green標記的線粒體的共定位成像結果。
（c）LipidSpot488標記的脂滴的共定位成像結果。
（d）LysoView488標記的溶酶體的共定位成像結果。
（e）LaminA-EGFP標記的核膜的共定位成像結果。
（f）H2B-EGFP標記的染色體的共定位成像結果。
右側圖像為左側黃色虛線框所示區域的放大圖像。比例尺：5 μm (左側) 及 1 μm (右側)。
圖4.黑色液泡小體在核周區域生成並最終與細胞膜融合的全過程（視頻）。
（來源：科學網）
相關論文信息：https://doi.org/10.1038/s41377-020-0249-4