NSCLC中融合基因有經典的ALK、ROS1，還包括一些逐漸被重視的融合基因如RET、NTRK1/2/3、NRG1、FGFR1/2/3等。融合基因的檢測方法有哪些，目前以此為靶點的藥物使用進展為何，今天衡道病理特邀中國科學院大學附屬腫瘤醫院（浙江省腫瘤醫院）病理科副主任蘇丹教授詳細闡述。
蘇丹
醫學博士, 研究員，博導
中國科學院大學附屬腫瘤醫院（浙江省腫瘤醫院）病理科副主任
中國抗癌協會病理學專委會委員
中華醫學會病理學專委會分子病理組委員
中國抗癌協會腫瘤精準治療專委會委員
中國抗癌協會腫瘤病因學專委會委員
浙江省抗癌協會腫瘤病因學專委會副主任委員
浙江省抗癌協會腫瘤精準治療專委會副主任委員
浙江浙江省臨床病理質控中心專家委員會委員，分子組副組長
浙江省智能診斷和分子技術研發中心副主任
浙江省胸部腫瘤重點實驗室副主任
非小細胞肺癌（NSCLC）是最常見的肺癌亞型，約佔肺癌的85%，目前NSCLC的驅動基因較為明確，其驅動基因的變異形式主要包括基因突變、拷貝數變異、基因融合等[1]。
融合基因由染色體結構重排引起，造成兩個或多個不同基因的編碼區首尾相連，置於同一套調控序列（包括啟動子、增強子、核糖體結合序列、終止子等）控制之下，構成新的嵌合基因[2]。基因融合是腫瘤發生發展的常見機制之一，有研究表明在多達17％的實體瘤中鑑定出至少一種基因融合體，基因融合會導致激酶持續性激活從而引發癌症，此外，基因融合也是目前部分靶向治療獲得性耐藥的機制之一[3]。NSCLC中融合基因有經典的ALK、ROS1，還包括一些逐漸被重視的融合基因如RET、NTRK1/2/3、NRG1、FGFR1/2/3等，此外，研究表明EGFR、BRAF、MET及ERBB2等常見驅動基因也會發生基因融合變異[4]。攜帶基因融合變異的NSCLC統稱融合變異型NSCLC，約佔NSCLC的10%-15%左右，近年來越來越受到臨床關注。
隨著ALK，ROS1等融合基因的靶向藥物獲批進入臨床治療， NSCLC的融合基因檢測已成為肺癌常規診療中的一部分。合理選擇融合基因診斷方法對於有效預測患者獲益具有非常重大的意義。目前臨床常用的融合基因檢測方法包括螢光原位雜交（FISH）、免疫組織化學（IHC）、逆轉錄聚合酶鏈反應（RT-PCR）和二代測序（NGS）等[5-13]。
IHC技術：
通過特異性單克隆抗體檢測融合蛋白表達情況。IHC方法本身具有耗時短，成本低，且已實現全自動操作等優點，可作為一些融合基因如ALK融合及NTRK融合等的篩查手段。但在缺乏特異性強的檢測抗體時，IHC的假陽性率和假陰性率均較高（如目前RET融合的IHC檢測）。對於未經獲批的IHC檢測方法診斷的陽性結果，建議進一步使用其他檢測手段進行驗證。
FISH技術：
該技術通過螢光標記的DNA探針來鑑別感興趣的核苷酸序列，可以檢測拷貝數，擴增和染色體結構改變（例如基因重排）。融合變異型肺癌中FISH不僅可以檢測已知融合，還可檢測未知融合，且由於其結果的可靠性及穩定性，仍然是目前檢驗其他檢測技術準確性的重要手段，如ALK斷裂探針被認為是ALK融合檢測的金標準。
但該技術本身存在一定的局限性，如
（1）腫瘤組織的異質性可能影響FISH檢測的結果偏差；
（2）某些罕見或未知的斷裂與融合位點間距可能小於FISH可判讀的最小閾值，從而導致假陰性的產生；
（3）整個檢測過程耗時較長，成本高，對操作和判讀技術要求較高，診斷醫師必須經過嚴格的FISH操作和結果判讀培訓，因此該技術不適用於大規模篩查性診斷。
RT-PCR技術：
RT-PCR技術通過將RNA在逆轉錄酶和特異性引物作用下逆轉錄成cDNA，然後設計探針對基因融合位點進行檢測，從而判斷基因是否發生融合。RT-PCR技術的特點在於周期短、敏感性高、操作和結果判讀相對簡單，因此廣泛應用於融合基因的篩選研究中，也是目前基因融合檢測廣泛應用的手段之一。該技術的主要局限性為只能檢測已知的基因融合類型，不能檢測未知的融合類型，因此存在假陰性的可能性。此外，RT-PCR對RNA模板的質量要求高，對於福馬林處理過的樣本可能由於RNA降解導致假陰性。
二代測序（NGS）技術：
NGS 優勢在於可有效檢出已知和未知的融合基因類型，可彌補常規檢測方法存在的漏檢、或不能明確融合伴侶基因等不足。按照檢測模板的不同，可以分為DNA-based NGS和RNA-based NGS。由於基因融合斷裂位點多在內含子，且斷裂位置不確定，因此DNA-based NGS檢測基因融合理論上需要全面覆蓋基因的內含子和外顯子區域，如果未能完全覆蓋則可能會造成假陰性結果。RNA-based NGS則有望彌補這一不足，RNA-based NGS檢測基因融合的探針只需要覆蓋外顯子，探針設計難度較DNA更低，還可以檢出轉錄水平剪切形成的融合基因，但受到RNA質量的影響，不能同時對基因突變進行檢測。
美國國家綜合癌症網絡（NCCN）NSCLC指南提出對於在廣泛組合的檢測中未發現驅動基因的患者（尤其是非吸菸者），考慮採用RNA-based NGS檢測，以最大程度地發現融合事件。基於ctDNA的NGS融合基因檢測研究數據也在不斷豐富，血液中ctDNA含量因腫瘤不同而差異較大，有研究提示基於ctDNA的NGS融合基因檢測敏感性低於組織檢測。ctDNA可作為組織樣本不可及患者的融合基因檢測補充選擇，但目前還缺乏相應的檢測標準和規範。
ALK
間變性淋巴瘤激酶（ALK）最早作為間變性大細胞淋巴瘤的一個亞型被發現，並因此得名。伴有ALK基因融合的肺癌是NSCLC一個重要的臨床亞型。ALK基因融合在我國非小細胞肺癌中的發生 率 約 5.6%，其 中 腺 癌 的 發 生 率 為 6.6%~9.6%，並與KRAS和EGFR突變相排斥。
近年來ALK 抑制劑的研發和臨床應用取得 了 較 大 的 突 破 ，已經成為NSCLC中ALK重排患者重要的治療手段，包 括 一 代［如 克 唑 替 尼（Crizotinib）］、二代［如阿來替尼（Alectinib）、塞瑞替尼（Ceritinib）、Brigatinib］乃 至 三 代 ALK 抑 制 劑（Lorlatinib），可明顯提高ALK 陽性晚期NSCLC患者的客觀緩解率並延長無進展生存期[7]。隨著越來越多的 ALK 基因罕見融合亞型的發現，以及 ALK 抑制劑獲得性耐藥機制的闡明，臨床對 ALK 基因檢測提出了更多的需求。根據患者需要，選擇準確、快速、恰當的 ALK 檢測方法，篩選出適用 ALK 抑制劑的目標人群具有重要臨床意義。
ALK 基因重排導致 ALK 融合基因的表達這一分子生物學基礎決定了檢測ALK 基因融合可以在多個分子水平上進行，2019年發布的《中國非小細胞肺癌ALK檢測臨床實踐專家共識》中提出已獲批的Ventana-D5F3 IHC、FISH、RT-PCR、NGS 檢測方法均可用於 ALK 基因融合診斷[14]。
ROS1
ROS1融合基因是一種獨特的受體酪氨酸激酶，與ALK同屬胰島素樣受體酪氨酸激酶超家族成員，二者胺基酸序列上具有近49%的相似性，在激酶催化區的ATP結合位點同源性高達79%，且臨床特徵上也非常相似。ROS1融合基因在NSCLC中發生率約為1%-2%，和ALK相似，常見於年輕，不吸菸的腺癌患者。2020年中國臨床腫瘤學會（CSCO）NSCLC指南中指出ROS1融合是NSCLC的另一種特定分子亞型，已有多個研究表明晚期含有ROS1融合的NSCLC患者接受克唑替尼治療有效[7]。
ROS1融合的檢測方法包括FISH法，RT-PCR法，IHC法及NGS法。FISH方法為NCCN指南推薦的ROS1融合基因檢測方法，價格較高，操作規範要求高，目前還沒有FDA獲批的FISH檢測；RT-PCR對標本質量要求高，需專用的試劑盒進行檢測，目前國內已有多個試劑盒獲得NMPA批准；IHC簡便易行，但陽性標準不統一，有一定的假陽性。《中國ROS1陽性非小細胞肺癌診斷病理專家共識》指出結合靶向藥物臨床試驗數據，推薦使用經過驗證的技術進行ROS1融合基因的檢測，首選國家藥品監督管理局（NMPA）批准的RT-PCR檢測，其次是經過驗證的FISH檢測平臺，ROS1的IHC結果不能直接指導臨床用藥，需採用其他技術進行確認[15]。
RET
RET基因融合在NSCLC中發生率為1%-2%，我國每年新增NSCLC-RET陽性人群約1.1萬人。RET基因最常見的斷裂位點位於內含子11，部分融合斷點位於內含子7和內含子10，至今已發現至少50餘種RET融合變體，其中以KIF5B-RET，CCDC6-RET最為常見。RET融合通常與EGFR，ROS1，BRAF，METex14跳躍和ALK變異相排斥，且RET融合的患者對免疫治療獲益有限[16]。兩款高選擇性RET抑制劑selpercatinib和普拉替尼（pralsetinib）因在晚期RET融合陽性NSCLC中顯示出良好的抗腫瘤活性和安全性，已獲得美國FDA批准用於轉移性RET融合陽性非小細胞肺癌，其中普拉替尼膠囊已獲得NMPA已正式受理的上市申請並納入優先評審，用於治療經含鉑類化療的RET融合陽性的NSCLC患者[17]。
RET融合檢測標準和推薦方法還無定論， NCCN指南推薦包括RET融合基因在內的更廣泛的分子譜檢測，以鑑別有可及藥物的罕見驅動突變，或就臨床試驗的可能性向患者提供適當的建議[5]。CSCO NSCLC診療指南（2020）推薦通過NGS確定包括RET融合在內的具有臨床意義的目標靶點（2B類證據）[7]。另外，RET融合也是EGFR TKI獲得性耐藥機制之一，對於EGFR-TKI耐藥患者，也建議再次進行RET基因檢測[18,19]。目前，可用於RET基因檢測的方法包括RT-PCR、FISH、NGS等，但每種方法都具有優缺點，有條件的實驗室可以在檢測時進行相互補充和驗證。目前國內已有多個獲批的包含RET基因融合變異的NGS和RT-PCR檢測試劑盒。
NTRK
NTRK 基因融合可見於多種實體腫瘤，在一些罕見腫瘤中頻繁發生，在肺癌、乳腺癌、甲狀腺癌、結直腸癌等常見腫瘤中也佔有一定比例。針對這一靶點的藥物獲批，給罹患不同癌症的患者都帶來了新的希望，各個癌種的權威指南均提示，只要檢出腫瘤攜帶NTRK 基因融合，就可以考慮使用相應的靶向藥物治療。NTRK 基因融合在NSCLC 中發生率僅為0.2%，但在無常見驅動基因突變的NSCLC 中發生率可增至3%[20]。
2019 年第 3 版NCCN NSCLC 指南開始新增NTRK 基因融合為肺癌靶向用藥相關基因檢測，目前可選擇的方法有IHC、FISH、RT-PCR和NGS。由於NTRK在多種腫瘤中都存在融合，且發生頻率差異較大，在選擇NTRK 基因融合檢測方式時，需考慮時間、技術、成本等多種因素[5]。歐洲腫瘤內科學會（ESMO）指南提出了「兩步方案」的檢測方法。在NTRK 基因融合發生率低的腫瘤中，可以選擇pan-TRK IHC 這種快捷可靠的篩選方法。當前期檢測顯示 TRK 蛋白表達陽性的情況下，推薦用 NGS 證實是否存在特定的基因改變。對於低NTRK 基因融合發生率和低 TRK 蛋白表達的NSCLC來說，未常規行分子檢測的患者，推薦先行 pan- TRK IHC 進行評估；已行分子檢測且常見靶點如 EGFR、ALK、ROS1 等均為陰性的患者，首先推薦包含 NTRK 基因融合的 NGS。當懷疑存在特定的 NTRK 基因融合類型時，可考慮選擇FISH 或RT-PCR 檢測[21]。
染色體結構重排可導致基因之間編碼或調控DNA序列的交換從而引起基因融合。融合類型與腫瘤表型之間的緊密聯繫使融合基因成為理想的診斷目標，不僅使腫瘤實體得以細分，還提供了風險分層的重要信息。當前，越來越多融合基因編碼的嵌合蛋白成為腫瘤的治療靶標，如RET融合， NRG1融合[22]以及FGFR融合[23]等新興的治療靶點為肺癌患者治療帶來了新的希望。融合基因的診斷策略將隨著臨床研究的不斷推進而隨之調整，基因融合的診斷還需要更多的研究數據來幫助患者和醫生選擇合適的檢測方法。
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