​PNAS | 擬南芥PATRONUS蛋白是分離酶抑制劑!新研究揭示細胞分裂過程染色體分離的調控機制

真核生物的細胞周期包含間期和分裂期兩個階段，細胞分裂又分為有絲分裂和減數分裂，其核心事件都是染色體的分離。有絲分裂中姐妹染色體的分離需滿足兩個條件：第一，連接姊妹染色單體的黏連蛋白降解；第二，姐妹染色單體在紡錘絲的牽引下分別移向細胞的兩極。減數分裂過程染色體的分離行為更加複雜，減數分裂包含一次染色質複製，兩次細胞分裂。在減數分裂I，染色體臂上的黏連蛋白降解，著絲粒附近的黏連蛋白仍然保留，導致同源染色體分離，姊妹染色單體仍然相互黏連；減數分裂II，著絲粒附近的黏連蛋白降解導致姐妹染色單體的分離【1】。黏連蛋白的降解由分離酶催化【2】，為了保證黏連蛋白在恰當的時期降解，分離酶的活性被嚴格的調控。在真菌和動物中分離酶的催化活性可被分離酶抑制劑所抑制，分離酶抑制劑作為分離酶的假底物與分離酶結合後阻止了分離酶與黏連蛋白的結合【3】。在細胞分裂後期剛開始的時，分離酶抑制劑被後期促進複合物介導的泛素化修飾途徑所降解【4】。分離酶在真菌，動物和植物中都被報導，功能類似，而分離酶抑制劑只在真菌和動物中發現，植物中一直沒有發現分離酶抑制劑，這一度讓研究者懷疑植物中是否存在通過分離酶抑制劑調控分離酶活性的機制。

近日，來自法國巴黎-薩克雷大學的Raphael Mercier教授團隊通過遺傳學，生物化學等手段揭示了擬南芥PATRONUS蛋白就是分離酶抑制劑，填補了植物分離酶抑制劑研究的空白。相關結果以Patronus is the elusive plant securin, preventing chromosome separation by antagonizing separase為題發表於雜誌PNAS上。

 

擬南芥的PATRONUS蛋白由兩個同源基因所編碼，PANS1 和 PANS2。前期研究已發現在pans1突變體中，姐妹染色單體間的黏連蛋白提前降解，導致減數分裂II過程染色體錯誤分離【5】。但是PANS1調控黏連蛋白降解的機制一直不清楚。pans2 單突沒有表型，但是與pans1雙突後致死。PANS1在N端含有D-box和KEN-box兩個結構域，通過這兩個結構域PANS1與後期促進複合物結合，然後經過泛素化途徑降解。研究者將PANS1的D-box突變後回補到pnas1中構建PANS1ΔD株系，PANS1ΔD產生了與pnas1完全相反的表型，包括黏連蛋白無法降解，減數分裂中期I拉長，染色體二價體及姐妹單體無法分離等。這些結果進一步證實了PANS1對於黏連蛋白的保護作用。

 圖1：Immunolocalization of the cohesion REC8 was performed on meiotic chromosome spreads stained with DAPI.

為了探索PANS1保護黏連蛋白的內在機制，研究者進行了pnas1抑制子的篩選。研究者發現分離酶AtESP基因的突變可以恢復pnas1的表型，證明PANS1和分離酶以相互拮抗的方式調控黏連蛋白的降解。並且PANS1ΔD的表型與esp突變體表型類似，暗示著當D-box突變後，PANS1不能被後期促進複合物介導的泛素化途徑降解，PANS1大量積累抑制了分離酶的活性，使得黏連蛋白不能降解。研究者又通過pull down，Y2H和BiFC 證明了PANS1在體內和體外均可以和分離酶相互作用，進一步證明了上述推測。最後研究者通過序列比對分析發現雖然植物的PANS和真菌及動物的分離酶抑制劑序列相似度比較低，但它們都存在三個保守的結構域：N端的D-box和KEN-box結構域，這兩個結構域介導PANS與後期促進複合物的結合，以及中部區域的一個含有保守的穀氨酸殘基的結構域，這個結構域對於抑制分離酶活性是必須的。

 

圖2：Mutations in SEPARASE suppress pans1.

綜上所述，該研究證實了PATRONUS是植物的分離酶抑制劑，通過抑制分離酶活性來保護黏連蛋白。進一步明確了植物細胞分裂過程染色體分離的調控機制。

參考文獻

【1】MERCIER, R., MEZARD, C., JENCZEWSKI, E., MACAISNE, N. & GRELON, M. The molecular biology of meiosis in plants. Annu Rev Plant Biol, 66, 297-327(2015).

【2】J. Kamenz, S. Hauf, Time to split up: Dynamics of chromosome separation. Trends Cell Biol. 27, 42–54 (2017).

【3】 S. Luo, L. Tong, Molecular mechanism for the regulation of yeast separase by securin. Nature 542, 255–259 (2017).

【4】S. Hauf, I. C. Waizenegger, J. M. Peters, Cohesin cleavage by separase required for anaphase and cytokinesis in human cells. Science 293, 1320–1323 (2001).

【5】 L. Cromer et al., Centromeric cohesion is protected twice at meiosis, by SHUGOSHINs at anaphase I and by PATRONUS at interkinesis. Curr. Biol. 23, 2090–2099 (2013).