在妊娠早期，哺乳動物胚胎植入子宮壁是胚胎與母體組織建立聯繫的關鍵過程。然而，由於植入的胚胎被子宮組織所包裹，其在植入過程中與母胎界面的細胞相互作用本質上難以進行深入分析，因此，胚胎和母體之間相互聯繫的調控機制仍知之甚少。近期，來自德國馬普分子生物醫學研究所的Govindasamy團隊發表的題為「3D biomimetic platform reveals the first interactions of the embryo and the maternal blood vessels」的文章中，作者建立了一個3D仿生培養環境，其中包含了小鼠植入微環境的關鍵特徵。此培養系統能夠直接分析滋養層細胞的侵潤，並揭示了胚胎與母體血管系統的首次相互作用。此研究闡明了植入部位早期細胞相互作用的隱藏動力學。接下來請跟隨小編一起來看一下這篇文章吧~
為了探究從植入前到植入後發育過程中滋養層細胞與周圍母體組織的空間結構特徵，作者使用了整體組織透明和成像。為了捕捉到滋養層細胞的侵潤過程，作者使用了在Eome調控序列(knockin)控制下表達膜結合tdTomato(mTom)的報告鼠，對早期胚胎中的滋養層細胞譜系進行標記。然後對包含E4.5,E5.0以及E5.5胚胎的子宮進行mTom、內皮細胞(PECAM-1)和上皮細胞(E-cadherin)標記染色。另外，作者還對此子宮用表達肌動蛋白細胞骨架報告Lifeact-GFP，上皮細胞marker OCT4以及PECAM-1進行染色。Eomes-mTom和Lifeact-GFP胚胎的整體成像顯示，滋養層細胞的侵潤始於滋養外胚層（TE）壁層的多個部位，並在E5.0-E5.5階段的植入部位建立了緻密的毛細血管網絡。接著，作者使用流式細胞術發現與未蛻膜化（E4.5）的子宮內膜相比，在E5.5蛻膜中，PECAM-1陽性(內皮marker)細胞的數量增加了8倍。同時作者發現，E5.0-E5.5胚胎的侵潤性滋養層巨細胞（TGC）與周圍的母體血管相互混合，這表明滋養層細胞與母體血管存在交互關係。（圖1）
圖1. 胚胎-母體界面的空間結構
為了直接觀察和闡明滋養層細胞侵潤和與血管相互作用的機制，作者建立了一個模擬植入部位的人工合成的三維(3D)環境。作者假設，與蛻膜化的子宮內膜間質相類似的合成環境包括三個關鍵特徵：一是可降解性，這是由於侵襲性的TGCs可釋放基質金屬蛋白酶MMPs，介導母體組織的滲入和重塑；二是生物力學特徵（硬度）與蛻膜類似；三是存在粘連部位從而介導細胞互作。為了實現這些特徵，作者使用了基於甲基丙烯酸葡聚糖(DexMA)或聚乙二醇(PEG)的合成成分來建立此模型，這是由於這些材料可以加工成具有可調硬度以及細胞粘附和降解特性的水凝膠。這種水凝膠是通過摻入MMP可裂解的肽序列、交聯的DexMA或PEG大單體來實現的。接著，作者打開新鮮分離的E5.5蛻膜並取出胚胎，用原子力顯微鏡(AFM)檢測植入部位蛻膜的硬度，發現蛻膜的平均彈性模量約為0.4kPa。然而此蛻膜硬度雖在體外可以實現，但簡單培養水凝膠中的胚胎不足以支持滋養層細胞的侵潤。因此，作者對支持細胞-基質相互作用的粘附部位進行進一步分析。首先，作者觀察了蛻膜中細胞外基質成分的表達情況，發現整合素配體如層粘連蛋白和纖維連接蛋白在蛻膜中表達，而整合素β1在滋養層細胞中表達。接著為了探究整合素粘附是否參與了滋養層細胞的侵潤，作者對PEG和DexMA水凝膠進行了修飾，通過摻入存在於纖維連接蛋白分子粘附位點的RGD肽序列來實現整合素結合。作者發現，與非粘附性水凝膠相比，生長在粘附性(+RGD)水凝膠中的胚胎滋養層細胞從TE的壁部開始侵潤（與體內一致）。從培養的第1天到第3天，滋養層細胞侵潤深度隨胚胎的生長逐漸增加，這與體內E4.75-E5.5的滋養層細胞侵潤相類似。為了觀察滋養層細胞侵潤的動態，作者對表達Lifeact-GFP的胚胎進行了時間推移記錄，發現滋養層細胞侵潤過程表現出細胞集體遷移的特徵。同時，侵入的滋養層細胞被集中成鏈狀分布，其前緣的細胞出現了富含肌動蛋白的突起。這些細胞形成絲狀和偽足，進而感知周圍環境，這與子宮中的TGC相類似。（圖2）
圖2. 支持滋養層細胞宮外侵潤的3D合成環境的建立
由於DexMA的基質可加工成既不會膨脹也不會收縮的水凝膠，從而能夠在合成環境中進行3D建模以及生成血管結構，因此作者將這種材料納入微流控晶片，該晶片包含嵌入到填充有內皮細胞水凝膠中的管狀通道。為了模擬和分析滋養層細胞與母體血管系統之間的相互作用，作者在微流控裝置中使用可增殖的bEnd5內皮細胞與胚胎進行共培養。通過對滋養層細胞侵潤和血管新生的過程實時捕捉，發現TGCs和內皮細胞經歷了定向遷移，從而建立了兩者之間的聯繫，這為兩者之間進行信號交互提供了直接證據。（圖3）
圖3. 微流控晶片中滋養層細胞-內皮細胞互作分析
為了探究胚胎和母體血管之間在分子水平上的相互關係，作者通過 RNA-seq分析了滋養層細胞和內皮細胞的轉錄圖譜。首先，作者分析了與壁TE分化為侵潤性TGC相關的轉錄變化。作者使用雷射輔助顯微解剖分離了E4.5(未植入的胚胎)和E4.75囊胚(最初植入子宮壁)的壁TE，結果發現從E4.5到E4.75再到TGCs的壁TE的發育過程與未分化的TE marker如Cdx2下調以及TGC marker如Hand1上調有關。此外，在滋養層細胞分化過程中，一系列血管(內皮細胞、周細胞和血管平滑肌)marker在TGC中上調。此外，作者對100個最豐富的基因進行聚類分析發現TGCs與內皮細胞聚在一起。同樣，GO分析發現了侵潤的滋養層細胞中存在與血管生成、血管發育和形態發生相關的基因表達，包括VE-cadherin (Cdh5), PECAM-1, Dll4, Notch3, Vegfr2(Kdr), Pdgfrb,以及Pdgfra。（圖4）
為了驗證血管marker在子宮中的表達，作者對含有膜-tdTom(mT/mG)或Eome-mTom胚胎的蛻膜分別進行DII4和PECAM-1染色以及對含有VE-cad-GFP或PDGFRA-H2B：GFP報告胚胎的蛻膜進行滋養層細胞marker Cdcp1和Oct4染色。結果發現，侵潤性的滋養層細胞激活了Dll4、PECAM1、VE-cadherin(VE-cad-GFP)和Pdgfra(Pdgfra-H2B：GFP)的表達。（圖5）
圖5.侵潤性的滋養層細胞中血管基因的表達
接著，作者欲探究TGC中血管marker的上調是否在功能上與母體血管的細胞間通訊有關，因此採用iTalk資料庫對E5.5蛻膜內皮細胞(體內)和bEnd5細胞(體外)內皮細胞的轉錄組進行分析，並著重分析了在TGCs和內皮細胞之間潛在的配體-受體互作。結果發現了多個配體-受體的信號通路網絡，包括VEGF、Notch、Pdgf、Igf、Egf、Tgfb、整合素和其他信號通路。接著作者為了研究三種血管生成途徑，即Vegf、Notch和Pdgf通路在滋養層細胞-內皮細胞相互作用中的潛在功能，將胚胎和bEnd5細胞共培養在加入三種途徑相應化學抑制劑的培養基中。結果發現，在Notch或Pdgf信號抑制劑的存在下，滋養層細胞與內皮細胞之間的接觸次數顯著減少，而此結果在加入Pdgfr抑制劑後最為明顯，且TGCs鏈向內皮細胞的定向遷移能力明顯減弱。此前有研究表明，Pdgf信號通過向附著於內皮細胞並聚集在血管外壁的周細胞傳遞信號來參與血管新生過程；另外，Pdgf信號在生長的血管中的表達促進了周細胞的招募，而周細胞又表達了Pdgfb受體。以上結果表明，內皮細胞和TGCs之間的相互也涉及類似的機制，Pdgf信號可以促進胚胎-母體界面細胞互作。（圖6）
圖6. 滋養層細胞通過血管生成信號與母體血管溝通
在這篇文章中，作者建立了一個3D仿生培養環境，以可合成的水凝膠與嵌入的微流體為基礎，揭示了小鼠胚胎植入的動力學過程以及植入部位的關鍵特徵，闡明了小鼠胚胎與母體血管的首次互作。在這一環境中，作者通過直接觀察胚胎植入的過程，發現侵潤的TGC呈線狀分布，表現出細胞集體遷移的特徵(圖7)。其中最尖端的TGCs可以作為先導細胞，感知周圍環境，引導胚胎植入母體子宮。除此之外，作者還發現侵潤性的滋養層細胞激活了大量的血管受體、配體和細胞黏附分子的表達，形成了與母體血管溝通的網絡。其中，Pdgf信號通路促進侵潤性的滋養層細胞和內皮細胞之間建立聯繫，當抑制Pdgf信號通路後，小鼠胚胎與母體血管的通訊明顯減少。雖然此模型以小鼠胚胎為基礎，但為未來建立支持其他哺乳動物胚胎發育的3D培養環境提供了廣闊的前景，並將進一步拓寬我們對胚胎與母體互作的理解。（圖7）
圖7.植入部位滋養層細胞侵潤與胚胎-母體血管互作示意圖
參考文獻
Govindasamy N, Long H, Jeong HW, et al. 3D biomimetic platform reveals the first interactions of the embryo and the maternal blood vessels [published online ahead of print, 2021 Nov 2]. Dev Cell. 2021;S1534-5807(21)00845-5.
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生命樹之謎：
中國科學院動物研究所生殖病理學研究組（PI：王雁玲研究員）
http://sourcedb.ioz.cas.cn/zw/zjrc/200907/t20090716-2088415.html
http://rpb.ioz.cas.cn/yjz/wangyanling/
中國科學院動物研究所生殖生理學研究組（PI：王紅梅研究員）
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