以下文章來源於幹細胞者說 ，作者步步先生
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「工欲善其事，必先利其器」，我們淺談一下間充質幹細胞的生產工藝。
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書接上回，上一期我們簡述了間充質幹細胞的研發歷程，從國際視野角度介紹了全球間充質幹細胞藥物研發現狀，指出了幹細胞藥物開發面臨的困難。
如果要開發一種「現貨型」異體間充質幹細胞療法，規模化生產是阻礙其成藥的一個重要因素。本期，我們將淺談一下間充質幹細胞的生產工藝。
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間充質幹細胞產品開發的起點
1976年，Freidenstein 等[1]首次發現在骨髓裡存在一群非造血的骨髓基質細胞，呈克隆性貼壁生長，形態和成纖維細胞相似。最初被定義為成纖維細胞集落形成單位，之後更名為間充質幹/基質細胞 （Mesenchymal Stem/Stromal cell，MSCs）。如今，MSCs 已從人類許多其他來源組織中分離和鑑定出來，廣泛分布於幾乎所有組織（包括胎兒和成人），例如骨髓、血液、臍帶、臍血、胎盤、脂肪、羊膜、羊水、牙髓、皮膚、經血等等。
2006年[2]，國際細胞治療協會（ISCT）給出了人源MSCs最基本定義：
[1] MSCs在標準培養條件下，呈貼壁生長；
[2] MSCs表達CD105、CD73和CD90，不表達CD45、CD34、CD14或CD11b、CD79α或CD19及HLA-DR表面標記；
[3] MSCs在體外可以分化為成骨細胞、脂肪細胞和成軟骨細胞
目前，國際獲批上市的 MSCs 產品近10種。隨著大家對 MSCs 治療效果的逐步認可和觀點的逐步改變，在不久的將來，將可能有更多 MSCs 產品將獲批。有一篇報告[3]描述，細胞產品大概分三種劑量：低劑量（2X10*6 /劑），中劑量（1X10*8 /劑）、高劑量（1.5X10*9 /劑）。
目前，臨床使用的 MSCs 種類各不相同，來源於不同組織（包括骨髓、臍帶、胎盤、脂肪等）。雖然不同組織來源的 MSCs 均能符合國際細胞治療協會（ISCT）制定的最低標準，但依然有不少研究的結果提示不同組織來源的MSCs 具有某些差異性（比如細胞大小、增殖潛能、分泌細胞因子種類和數量，免疫抑制能力也不盡相同）。
圖1：MSCs來源於不同組織[4]
面對不同的適應症，我們可能會採用不同組織來源的 MSCs 產品進行治療。然而，採用不同的細胞分離技術，獲得的細胞質量可能千差萬別（比如臍帶血、骨髓來源的MSCs主要是密度梯度離心法，脂肪和臍帶來源的MSCs主要靠酶消化法）。因此，選擇合適的分離技術是獲得相對可靠、安全、高質量初代 MSCs 的關鍵。
如何選擇合適的 MSCs 生產製造工藝，主要取決於兩點：一是細胞劑量的要求，二是自體還是異體使用。
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間充質幹細胞產品生產工藝
下面，我們從幹細胞體外擴增方面，探討幾種間充質幹細胞製造工藝。
目前，間充質幹細胞製備技術分為兩大類，包括平皿製造工藝和生物反應器製造工藝。利用自體細胞來源的 MSCs 進行個體化治療，屬於小規模生產，各自企業的標準和工藝也不盡相同。異體細胞來源的 MSCs 規模化製造工藝是利用生物反應器，模擬其在體內的生長發育環境，進行高效率增殖。同時，可以滿足自動化、量產並能保證細胞的高活率和高質量的要求，這也是今後各種幹細胞規模化生產的發展趨勢。
平皿製造工藝
中小規模的臨床試驗通常使用平皿製造工藝，包括多層平皿培養體系，也稱「細胞工廠」（大約8-10層平皿，主要有Thermo Scientific、BD和Millipore等品牌），可以擴增出100億（10*10）個細胞，相對經濟有效。
事實上，在 Osiris Therapeutics 公司進行的早期臨床試驗中[5]就聲稱，只需一份捐獻的骨髓，便可製備多達10000份患者的劑量，用於治療GVHD。他們的細胞製備，使用的平皿製造工藝。從成本上來看，平皿製備工藝比較經濟。但是質控比較麻煩，需要的人工也多，同時也容易引入外來操作風險。
圖2：平皿製備工藝簡圖
比起人工手動操作，自動化平皿製造工藝略有進步，也具有在線監控功能，可以實現封閉式培養。例如，Xpansion Multiplate 便是自動化平皿培養的一種設備，由一堆平板（10-200層）組成，具有可擴展性[6]。據製造商[6]聲稱，這種200塊平板組成的系統一次開機，可生產200億（2X10*10）個細胞，但生產下遊不好處理。如果劑量處於100-1000億（1-10X10*10）個細胞之間，平皿製備工藝可以滿足MSCs的生產需求，但通常需要堆疊40層。這就需要更大的空間和自動處理裝置。
平皿製備工藝，無法滿足規模化的細胞生產需求（大於300億，即3X10*10細胞），這時候就需要引進新的工藝體系。比如，下面要介紹的生物反應器製備體系。
生物反應器製造工藝
生物反應器製備工藝，可作為體外培養的平皿製備工藝替代品。生物反應器，通常對細胞最小接種量是有要求的。早期的 MSCs 擴增，通常先是在平皿中手工操作進行，隨後再被接種到生物反應器中。簡單的攪拌容器，比平皿更有優勢，不但具有可擴展性，還可以提供均勻的最低濃度梯度(pH，溶解氧，代謝物)。如果細胞與微載體結合培養時，可在攪拌條件下固定並培養貼壁細胞，這無疑是最有效技術之一。
在這裡，介紹兩大類生物反應器類型：灌注式生物反應器（包含中空纖維生物反應器 ）與攪拌懸浮式生物反應器。
第一，灌注式生物反應器
灌注式生物反應器，是一種將MSCs附著在固定基質上的系統（如微珠），可連續交換介質，在排出介質的同時引入新鮮介質。灌注生物反應器由幾組平行板、中空纖維、固定床和流化床生物反應器組成。
圖3：灌注式生物反應器簡圖
灌注式生物反應器為細胞生長提供了一個連續的表面積，MSCs可單層附著在填充床表面上，但必須在低流速下灌注（通常不超過3X10-4m/s），使細胞剪切力最小，但這也會導致向細胞輸送的氧氣減少。通過解耦營養和氧灌注的策略，可以限制培養基的流動而不影響氧向細胞的擴散。一般而言，填充床反應器的細胞獲得率通常相對較低（18%），產量限制在約1億（10*8）個細胞。
中空纖維生物反應器，也屬於灌注式生物反應器的一種。它由一個容器和堆疊的半透性中空纖維組成，可以允許細胞生長在中空纖維毛細管的一個表面，而營養液和氧氣在另一個表面流動。其擴增效率大約是平皿製備體系的10倍（按照培養UC-MSCs計算）。
中空纖維生物反應器，每一次運行可生產4~6億（10^8）數量的MSCs，具有典型的商業特性。如果要開展臨床試驗需要供應足夠的MSCs，那麼則需要多個生物反應器才能實現。
因此，灌注式生物反應器配置更適合於自體的規模化生產，而不是異體細胞的規模化生產。
第二，攪拌懸浮式生物反應器
攪拌懸浮式生物反應器，主要用於MSCs的大規模生產。以旋轉瓶為原型，用攪拌臂將培養基在培養瓶中攪拌混勻。
圖4：攪拌懸浮式生物反應器簡圖
在攪拌懸浮式生物反應器中，MSCs通常附著在懸浮在攪拌容器中的微載體上。這類生物反應器可以產生多達5000億（50X10*10）個細胞（此類產品有Eppendorf、Thermo Scientific和PALL等品牌，國內華龕生物自主研發的3D FloTrix®vivaSpin 系列也屬於此類）。其範圍從小體量（3-250ml，適合工藝參數測試）到臺式規模（1.5-5L），再到中式規模（50-300L），最後到生產規模（500-2000L）。工藝下遊的處理需要連續離心，自動袋或小瓶填充等完成。
微載體
說到攪拌懸浮式生物反應器，這裡必須要講一下微載體（有SoloHill®，CultiSpher®-S，Cytodex®-1等品牌，國內自主研發品牌華龕生物3D TableTrix®）。微載體是幹細胞賴以附著生長和擴增的基質。微載體可以用各種材料（聚苯乙烯、纖維素、葡聚糖、玻璃、海藻酸鹽和明膠等）製備；可以為無孔，微孔，大孔；可以有表面塗層（膠原蛋白、纖維連接蛋白、層粘連蛋白和多聚賴氨酸等），也可以沒有。
簡單的說，如果說生物反應器是一個海洋，那微載體就是一個個島嶼，而幹細胞就是居住在這些島嶼上的居民。幹細胞可以在微載體上的有效擴增和分化，依賴其調節細胞形狀和形成組織的能力。由於微載體具有多樣性，利用特定微載體的合理設計，可能為規模化細胞製備提供均一穩定的製劑來源。
但微載體缺點也很明顯，比如微載體容易聚團，高速旋轉產生的剪切應力會對細胞造成損傷，微載體和幹細胞的分離也是個難題。
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文末小結
本期內容，我們簡單介紹了間充質幹細胞的生產工藝，包括平皿製造工藝和生物反應器製造工藝。開發者可以根據 MSCs 細胞藥物的自身特性（如自體/異體，劑量，劑型，規模），選擇合適的生產工藝。
作為細胞產品，必須確保進入臨床的每一劑細胞質量都是可靠的。有效的質量控制方法和標準，是幹細胞臨床安全性和有效性的基礎和前提。先進的生產工藝有選擇了，那麼我們如何能保證細胞產品的質量呢（比如：無菌性，安全性，活力，均一性，純度，穩定性和效力）。下一期，我們將針對間充質幹細胞的質控體系展開論述，敬請期待！
撰文：步步先生
來源：幹細胞者說
1980-2020
原標題：《【科學普及】間充質幹細胞治療（二）：先進位造工藝》
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