在許多爬行動物中，包括紅耳龜（T. scripta），性別取決於胚胎發生過程中的環境溫度。先前研究顯示，表觀遺傳調節因子Kdm6b在雄性產生溫度下升高，並且對於激活雄性途徑至關重要。
2020年4月17日，浙江萬裡學院葛楚天，錢國英及杜克大學Blanche Capel等人在Science 在線發表題為「Temperature-dependent sex determination is mediated by pSTAT3 repression of Kdm6b」的研究論文，該研究建立了溫度與Kdm6b轉錄調控之間的因果關係。該研究顯示，信號轉導和轉錄激活因子3（STAT3）在溫暖的雌性產生溫度下被磷酸化，與Kdm6b基因座結合，並抑制Kdm6b轉錄，從而阻斷了雄性途徑。Ca2 +的流入（STAT3磷酸化的介體）在雌性溫度下升高，並充當STAT3激活的溫度敏感調節劑。
溫度依賴型性別決定（temperature-dependent sex determination，TSD），是一種奇特的表型可塑性現象，其特徵是動物缺乏性染色體，性別完全取決於胚胎發育的環境溫度，常見於爬行動物（如龜）。自1966年Charnier發現TSD現象以來，其分子機理一直是未解之謎。TSD機制的解析主要在於解答兩個科學問題：（i）哪個（些）基因啟動未分化性腺向睪丸或卵巢分化？（ii）溫度如何調控這些基因的表達？Charnier團隊前期通過新建立的基因功能研究方法，鑑定了一個啟動中華鱉和紅耳龜雄性性腺分化的關鍵基因Dmrt1。因此，破譯TSD分子機制的關鍵在於解析溫度通過何種機制激活或抑制性腺分化啟動基因的表達？
STAT3磷酸化是溫度依賴性的，具有性二態性（圖源自Science ）
許多爬行動物的性別取決於卵在巢中發育的溫度。例如，在紅耳龜（T. scripta）中，胚胎雙能性腺在31°C [產雌溫度（FPT）]時分化成卵巢，而在26°C [產雄溫度（MPT）]時分化成睪丸。然而，這種依賴溫度的發育轉換的分子機制仍然難以捉摸。先前的研究表明，表觀遺傳調節劑KDM6B（JMJD3，組蛋白去甲基酶）是在26°C下表達保守的雄性別決定基因Dmrt1所必需的。在沒有KDM6B的情況下，雄性基因不會被激活，而雌性途徑會被啟動，從而導致卵巢的形成。KDM6B本身並非固有地對溫度響應，這表明上遊的熱敏調節劑必須提供溫度與性別特異性基因表達之間的缺失聯繫。
pSTAT3在31°C結合Kdm6b並抑制轉錄（圖源自Science ）
STAT3是控制Kdm6b表達的轉錄因子，它是這種調節劑的一個候選對象。STAT3的二聚化和轉運到細胞核取決於磷酸化，磷酸化可以通過響應環境或生理刺激的多種信號傳導途徑發生。該研究的分析表明，在紅耳龜胚胎中，在整個溫度感應窗口（第14到20階段）中，STAT3的轉錄本和蛋白質水平在26°和31°C時都相似。用磷特異性抗體進行的免疫螢光顯示，在第15和第17階段的整個胚胎生殖腺中，在31°C時，磷酸化的STAT3（pSTAT3）的水平升高，到20階段時大部分局限於皮質。根據這些結果，研究人員假設pSTAT3在31°C結合Kdm6b基因座，並作為Kdm6b轉錄的抑制劑。
通過抑制Kdmb6可以逆轉pSTAT3抑制誘導的從卵巢到睪丸途徑的轉換（圖源自Science ）
為了測試pSTAT3是否結合Kdm6b基因座，研究人員在第16階段收集了紅耳龜性腺，並對pSTAT3進行了染色質免疫沉澱（ChIP），然後使用引物對Kdm6b基因座5'端的兩個保守pSTAT3結合位點進行了定量聚合酶鏈反應（qPCR）。 pSTAT3在31°C時在Kdm6b基因座富集，其結合被HO-3867阻斷，HO-3867是STAT3磷酸化和DNA結合的抑制劑。
細胞內[Ca2 +]在31°C時升高與STAT3的溫度依賴性磷酸化有關（圖源自Science ）
為了確定pSTAT3是否可作為Kdm6b的阻遏物，研究人員將14階段全性腺-中甲複合物（GMCs）移植到31°C或26°C的器官培養物中。GMC暴露於兩種具有不同作用機理的pSTAT3抑制劑之一HO-3867或NSC 74859（S31-201，STAT3磷酸化和二聚化抑制劑），並在24小時後收集進行分析。根據免疫螢光和蛋白質印跡分析，兩種抑制劑處理後pSTAT3的水平均下降。逆轉錄後接qPCR（RT-qPCR）顯示，在暴露於任何一種STAT3磷酸化抑制劑後，Kdm6b及其下遊靶標Dmrt1的表達均在31°C上調。在26°C下，任一pSTAT3抑制劑均未顯著影響Kdm6b的表達。這支持了一個模型，其中pSTAT3抑制FPT處的Kdm6b轉錄。
為了確定pSTAT3抑制在體內是否具有相似的作用，研究人員在第14階段向卵中注射了遞增劑量的HO-3867（25、50和100μM），並在第16和21階段收集了性腺。與器官培養結果一致，pSTAT3抑制導致在31°C孵育的卵中Kdm6b和Dmrt1的上調。因此，經第21階段性腺中SOX9蛋白的異位表達確定，經HO-3867處理的23枚卵中有16枚（69.6％）表現出卵巢向睪丸的轉換。但是，在31°C抑制pSTAT3後，Dmrt1的上調可以通過用Kdm6b–RNAi（RNA幹擾）敲低Kdm6b的表達來防止，從而使卵巢發育恢復了92.9％（14中的13）。這些數據進一步支持了pSTAT3結合Kdm6b基因座以在31°C抑制雄性途徑激活的模型。
STAT3的磷酸化可以通過鈣信號通路來調節，該信號通路可以響應包括溫度在內的環境信號。為了研究溫度驅動的鈣信號傳導與性別決定之間的可能關係，研究人員從第15階段的紅耳龜性腺獲得了原代細胞。將單波長鈣指示劑Cal-520乙醯氧基甲酯（Cal-520 AM）引入培養的這些細胞中，以測量26°C或31°C時的相對鈣水平。總的來說，這些結果表明在31°C較高的鈣水平促進STAT3磷酸化。
綜上所述，該研究支持一種新的紅耳龜性別決定模型。根據該模型，在較高溫度（31°C）下，卵巢的發育是由鈣大量流入性腺細胞引起的。這促進了STAT3的磷酸化和Kdm6b的抑制，Kdm6b是睪丸決定通路的必需激活劑。
參考文獻：
https://science.sciencemag.org/content/368/6488/303