非洲豬瘟雙缺失鑑別診斷方法

2021-01-14 騰訊網

一種用於ASFV雙基因缺失鑑別診斷的三重實時螢光定量PCR方法

深圳海關公布了一種用於非洲豬瘟病毒MGF_360-14L和CD2v雙基因缺失鑑別診斷的三重實時螢光定量PCR方法，具體信息如下。

一

該方法的簡介

非洲豬瘟是由非洲豬瘟病毒（ASFV）引起的家豬和野豬的一種傳染病。在本研究中，作者建立了一種三重實時定量PCR方法來檢測和區分基因雙缺失的ASFV株和野生型ASFV株。本方法中，設計了3對引物和探針，分別針對B646L基因（p72）、MGF_360-14L基因（位於MGF360-505R基因中間）和CD2v基因的保守區。該方法特異性良好，可將基因缺失（MGF360-505R和/或CD2v基因缺失）和野生型ASFV株與PCV2、CSFV、PRRSV、FMDV、SVA或其他病原的核酸相互區分開。含B646L基因、MGF_-14L基因和CD2v基因的標準質粒DNA的檢測限分別為7.9拷貝、9.7拷貝和9.6拷貝。採用OIE推薦的三重rPCR和本文建立的實時定量PCR方法對1215份樣品進行了平行檢測，兩種方法的B646L基因檢測結果完全一致。成功地建立了三重定量PCR檢測方法，用於鑑定感染ASFV野毒株或感染ASFV雙基因缺失毒株的豬只。

二

該方法的特點

2.1 基因缺失的ASFV減毒疫苗已成為最有前途的ASF候選商品疫苗；

2.2 區分野生型ASFV和疫苗毒株的試驗方法對ASF的預防和控制至關重要；

2.3 本文採用三重實時螢光定量PCR方法檢測ASFV基因組中B646L基因、MGF_360-14L基因和CD2v基因；

2.4 三重螢光定量PCR法具有良好的特異性和敏感性。

三

該方法的實施

3.1引物

3.2 反應體系

最終的螢光定量PCR混合物含有THUNDERBIRD探針qPCR混合物（包括dNTPs、Mg2+、rTaq DNA聚合酶）、正向和反向引物各0.5μL（每個引物的最終濃度為200 nM）、TaqMan探針各0.3μL（最終濃度為120 nM）、DNA模板5μL，並用無核酸酶水配製至25μL。

3.3 反應條件

在合適的螢光定量儀器上可以進行螢光定量PCR反應，反應條件是如下：95°C 40 s，然後40個循環：95°C 8 s，58°C 45 s。在58°C下檢測螢光信號。

來源：李曼養豬大會

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