作者：常堯仁，劉純，殷麗華，蘭州大學口腔醫院口腔種植科
富血小板血漿（platelet rich plasma，PRP）1998年由Marx首次引入口腔醫學領域中，並被認為是第一代血小板濃縮物。2000年Choukroun提出了富血小板纖維蛋白（platelet-rich fibrin，PRF）的概念，作為第二代血小板濃縮物，它與PRP存在明顯差異，此術語的改變具有了裡程碑式的意義。
從PRF的提出到其衍生物純富血小板纖維蛋白（pure platelet-rich fibrin，P-PRF）、富白細胞血小板纖維蛋白（leukocyte-and platelet-rich fibrin，L-PRF）、改良型富血小板纖維蛋白（advanced platelet-rich fibrin，A-PRF）與可注射型富血小板纖維蛋白（injectable platelet-rich fibrin，i-PRF）以及第三代血小板濃縮物鈦制富血小板纖維蛋白（titanium platelet-rich fibrin，T-PRF）也已歷經十餘年的發展。
PRF及其衍生物已成功地應用於口腔醫學領域。不同類型的PRF衍生物其製備方法、保留時間、轉移過程、纖維蛋白結構、血小板以及釋放的細胞生長因子等存在差異。本綜述介紹PRF衍生物的演變、製備技術、生物學特性及醫學研究價值，為合理應用PRF衍生物提供科學參考與臨床指導。
1.PRF衍生物的演變
2000年第二代血小板濃縮物PRF被研發，相比於PRP，PRF避免了免疫排斥反應和過敏反應的可能，其三分子立體網狀結構為細胞的遷移、附著以及分化提供了有利場所。PRF內豐富的細胞生長因子，能與纖維蛋白發生化學鍵結合，從而形成較強的親和力，使得生長因子緩慢釋放，最終延長PRF在創口的作用時間，達到促進創口癒合的作用。
隨著研究的深入，學者們發現PRF中不僅含有豐富的細胞生長因子，且含有一定數量的白細胞，其免疫特性逐漸成為研究熱點。Dohan Ehrenfest等首次提出關於血小板濃縮物的分類，根據白細胞含量和纖維蛋白結構，將血小板濃縮物分為4個家族：1）純富血小板血漿（pure platelet-rich plasma，P-PRP）或去白細胞富血小板血漿（leukocyte-poor platelet-rich plasma，LP-PRP）；2）富白細胞富血小板血漿（leukocyte platelet-rich plasma，L-PRP）；3）P-PRF或去白細胞富血小板纖維蛋白（leukocyte poor platelet-rich fibrin，LP-PRF）；4）L-PRF。雖然PRF已經成功應用於臨床，但玻璃管中的二氧化矽顆粒可能導致的健康問題同樣也引起了醫學界的關注。
O』Connell指出，雖然二氧化矽顆粒會與紅細胞一起沉積，但其中的一部分仍會懸浮在纖維蛋白層中，進而直接接觸患者，增加潛在風險。2012年首次採用鈦制試管（Ⅳ級純鈦）代替玻璃試管進行靜脈血收集和離心，並命名為T-PRF。TPRF的產生基於金屬鈦，相比於二氧化矽更有利於血小板的激化，並可避免二氧化矽顆粒帶來的潛在風險，生物相容性更高。因此，T-PRF也被稱為第三代血小板濃縮物。
單核細胞在血管生成、骨組織再生等方面起著重要的作用。為了嘗試使PRF中包含更多的單核細胞，2014年Choukroun引進了A-PRF與i-PRF，並指出A-PRF/i-PRF更有利於軟組織生長與骨組織再生。
2. PRF衍生物的製備技術
2.1 P-PRF
臨床應用中PRP是一種液體或凝膠狀態，機械性能差，其釋放的生長因子易散失，為了方便操作並保存其中的生長因子，便將PRP繼續離心轉換成了P-PRF。P-PRF也稱為富血小板纖維蛋白基質（platelet-rich fibrin matrix，PRFM）。目前唯一可用於製備PRFM的是Fibrinet PRFM工具盒（Cascade Medical公司，美國），製備出的PRFM是以高活性凝膠形式存在的含有少量白細胞的高密度纖維蛋白網，其硬度是一般纖維蛋白凝膠硬度的600倍，可達到人類完整皮膚硬度的50%。
研究顯示，此工具盒可以將PRP中99.1%的血小板轉移至PRFM中，是最初收集全血中血小板含量的210倍。製備方法：9 mL全血1 100g高速離心6 min後紅細胞層與PRP層分離，然後將PRP完全轉移至含有CaCl2的凝集管中，4 500 g高速離心25 min即可製備出PRFM。
2.2 L-PRF
目前被美國食品藥品監督管理局（Food and DrugAdministration，FDA）批准的用於製備L-PRF的系統只有Intra-Spin L-PRF（Intra-Lock公司，美國）。Dohan Ehrenfest等指出，可用於製備L-PRF的機型還有A-PRF 12（Nice公司，法國）、Centrifuge LWUPD8（LW Scientific公司，美國）以及Salvin 1310（Salvin Dental Specialties公司，美國），但這3種機型均未獲得CE/FDA系統批准。應該注意的是，製備L-PRF的早期方案是3 000 r·min-1/10 min, 而近多年來2 700 r·min-1/12 min的方案更常被使用。
2.3 A-PRF
相比於L-PRF，A-PRF使用的轉速更低、離心時間更長，並需專有的血液收集管。A-PRF的製備方法：9~10 mL全血置於A-PRF12（Nice公司，法國）內1 500 r·min-1離心14 min，可見血液分3層，中間的淡黃色凝膠即A-PRF。但是學者通過1 300 r·min-1離心8 min製備出A-PRF+，並指出低速製備的A-PRF+相比於常規速度製備的A-PRF具有更多的生長因子。
2.4 i-PRF
Miron等在室溫下將10 mL全血置於Duo Centrifuge（Nice公司，法國）內700 r·min-1離心3 min，得到的上層液體即是i-PRF。Mourão等則將9 mL全血置於Horizontal centrifuge（RDE公司，巴西）內3 300 r·min-1離心2 min，得到的橙色液體便是i-PRF。
2.5 T-PRF
Tunali等在2011年收集了兔的10 mL靜脈血於鈦制試管中，於Hettich Universal 320（Hettich Zentrifugen公司，德國）內3 500 r·min-1離心15 min，血液分3層，中間淡黃色凝膠層即為T-PRF。其後，Tunali等收集9 mL志願者靜脈血於Hettich Universal320中2 800 r·min-1離心12 min，得到T-PRF。
3. PRF衍生物的生物學特性及醫學研究價值
3.1 P-PRF/PRFM
PRFM纖維蛋白網的兩面結構並不相同，一面可見血小板以及細胞黏附在纖維蛋白網上，血小板呈雙凸狀且處於未激活的狀態，另一面卻觀察不到血小板與細胞的存在，僅顯示為纖維蛋白網狀支架。含血小板及細胞一面的纖維相互纏繞為束狀，平均直徑達63.6 nm±30.3 nm。
不含血小板及細胞面的纖維更加粗大但相對較短，網狀結構更為緻密，表現出無孔狀態。PRFM的彈性模量（以剛度表示）為937.3 kPa±314.6 kPa，應力可達1 476.0 kPa±526.3 kPa。PRFM的硬度明顯高於L-PRF，但PRFM的抗張強度與最大抗拉應變低於L-PRF。PRFM釋放的生長因子有表皮生長因子（epidermal growth factor，EGF）、胰島素樣生長因子（insulin-like growth factor，IGF）1和2、血管內皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）、血小板衍生生長因子（platelet-derived growth factor，PDGF）AA和AB、轉移生長因子（transforming growth factor，TGF）β1、鹼性成纖維生長因子（basic fibroblast growth factor，bFGF），第一天釋放量最大，其後釋放漸減並表現平緩。
Lucarelli等發現，PRFM能顯著促進間充質幹細胞的增殖，但是否能促進間充質幹細胞的成骨分化還有待於進一步研究。Simon等對狗的拔牙窩癒合進行觀察，結果顯示PRFM組的拔牙窩3周後便有骨質充盈，12周後骨量明顯多於無PRFM的對照組，差異具有統計學意義。隨後，Simon等對患者的拔牙窩癒合進行了觀察，得出單獨使用PRFM可維持牙槽嵴的空間，減少牙槽骨吸收，並能促進快速成骨。PRFM還常被用於治療嚴重的慢性下肢靜脈性潰瘍、糖尿病足神經性潰瘍等，並取得了良好的臨床治療效果。
3.2 L-PRF
L-PRF可持續釋放生長因子，TGF-β1的釋放量最多，其次為PDGF-AB、VEGF和BMP-1。另有研究顯示，L-PRF與PRP相比，前者在7 d時間內釋放出更多的癒合分子（血小板反應蛋白-1、纖連蛋白以及玻連蛋白）及生長因子。Dohan Ehrenfest等比較了L-PRF與A-PRF，發現L-PRF釋放出的生長因子量始終比A-PRF強。
2018年，Lollobrigida等首次提出了液體L-PRF的概念，將種植體材料浸潤於液體L-PRF中，發現液體L-PRF可在種植體表面形成L-PRF凝膠，使更多的細胞黏附於種植體表面，而L-PRF浸出液雖然能促進種植體表面與纖維蛋白的結合，卻無法形成纖維蛋白凝膠。動物實驗表明，L-PRF在癒合早期階段可促進種植體周骨的癒合並顯著提高新骨生成量。
Bastami等的系統性綜述指出，上頜竇提升手術中，無論L-PRF作為單獨植入材料還是混合植入材料，對於骨再生均表現出了良好效果。L-PRF在軟組織癒合與再生方面表現尤為突出。
Temmerman等研究發現，與游離齦移植相比，L-PRF不僅能夠增加種植體周角化齦的寬度，還可縮短手術操作時間，減少患者的術後不良反應。種植體周圍炎的治療中運用L-PRF可取得良好的臨床治癒效果。與此同時，L-PRF在治療雙磷酸鹽相關的頜骨壞死疾病方面也表現出了良好的潛能。
3.3 A-PRF
A-PRF的三分子立體網狀結構比PRF與PPP更為疏鬆，網格空間更大，交聯密度更低，使得A-PRF的纖維蛋白網中存在更多的單核細胞、T淋巴細胞、B淋巴細胞、中性粒細胞、白細胞以及血小板。
Masuki等比較了A-PRF與PRP、富血漿生長因子（plasma rich in growth factors，PRGF）、濃縮生長因子（concentrated growth factors，CGF）中的生長因子及促炎因子，結果表明，A-PRF中TGF-β1、VEGF、白細胞介素（interleukin，IL）1β、IL-6的含量均高於其他各組。Cabaro等對比A-PRF與LPRF，發現A-PRF中嗜酸細胞活化趨化因子Eotaxin、CC類趨化因子配體5（C-C motif ligand 5，CCL5）、PDGF以及VEGF的含量均高於L-PRF，這與DohanEhrenfest等提出的觀點相反。A-PRF相比於L-PRF更能促進牙齦成纖維細胞的遷移及增殖。
Titirinli等在兔的下頜骨實驗中發現，2個月後A-PRF組新骨生成量顯著高於PRF對照組（P<0.05）。Kalash等在美學區即刻種植的隨機臨床對照試驗中，發現加入了A-PRF-異體骨的實驗組術後9個月的種植體穩定性顯著高於僅使用異體骨的對照組。Sameera等聯合A-PRF與L-PRF治療多發性齦退縮，術後6個月附著喪失及角化齦寬度均得到了明顯改善。A-PRF對口腔常見菌群如白色念珠菌、變異鏈球菌、金黃色葡萄球菌等均具有抗菌活性。
3.4 i-PRF
Varela等發現，相比於外周血中纖細的纖維蛋白網，i-PRF的網狀結構更為緻密，蛋白纖維也更粗壯，具有更多的血小板與白細胞，但血小板的分布表現為在某一區域內的凝集，並非均勻分布。Miron等對比了PRP與i-PRF，發現PRP具有較高的生長因子早期釋放，而i-PRF在10 d後生長因子總釋放量較高。i-PRF相比於PRP，對成骨細胞及牙齦成纖維細胞的遷移、增殖及成骨分化促進作用更加顯著。
兔動物實驗證實，i-PRF對軟骨缺損的重建具有顯著促進作用。臨床研究中，i-PRF可以與骨移植物混合，並在1~2 min內形成穩定的纖維蛋白—骨移植物，極大地方便了外科操作。在骨增量手術過程中，i-PRF還可以與A-PRF或PRF膜進行混合，加強其抗炎作用，更有利於骨組織和軟組織的癒合與再生。
慢性牙周病初期治療階段，通過根面刮治與根面平整術（scaling and root planig，SRP）與i-PRF聯合應用，探診深度、臨床附著喪失及探診出血相比於對照組（只應用SRP）得到了明顯改善，且牙周致病菌的含量明顯低於對照組。Karde等對比了i-PRF、PRF、PRP中血小板的含量及其抗菌活性，得出i-PRF中含有的血小板含量最高，抗菌活性也最高。i-PRF用於治療扁平苔蘚，也具有顯著的臨床效果，提示在使用糖皮質激素出現併發症的時候，i-PRF也許可以成為選擇。
3.5 T-PRF
Tunali等發現，T-PRF纖維蛋白網的覆蓋面積明顯大於L-PRF，且網狀結構更加完整有序，除此之外，T-PRF中細胞與纖維蛋白之間的邊界比L-PRF更寬且更突出。Takemoto等認為，這可能是由於鈦材料具有更好的血液相容性，導致能形成更多緊密聚合的纖維蛋白。Tunali等在兔的拔牙位點保存實驗中發現，術後1個月T-PRF組的拔牙窩內仍有T-PRF膜殘留，1個月及3個月時均有較多的VEGF及鹼性磷酸酶陽性細胞。
Firatli等在兔的顱骨缺損實驗中發現，T-PRF組表現出了更多的骨保護素陽性細胞，認為T-PRF可促進骨的癒合與再生。T-PRF在牙槽嵴增量手術及上頜竇提升手術中作為單獨植入材料也均表現出了良好的臨床效果。Uzun等運用T-PRF治療多發性齦退縮，術後12個月根面覆蓋率達到93.29%，角化齦寬度增加1.97 mm，說明T-PRF是一種安全有效的治療多發性齦退縮的生物材料。
4.展望
PRF衍生物是對PRF的不斷改進與完善，相比於PRF，PRF衍生物可產生更多的血小板、白細胞以及細胞生長因子，從而促進細胞的增殖與分化，利於組織的癒合與再生，同時由於其良好的機械性能，提高了手術的可操作性，並對術區具有一定的應力保護作用。低速離心分離的概念（low speed centrifugation concept，LSCC）2017年第一次提出。學者認為降低離心速度可以顯著地提高纖維蛋白中血小板、白細胞以及生長因子的含量，但是仍需要大量的臨床前以及臨床研究進行科學評估。只有了解了PRF衍生物的理化性能以及生物學特性，才能夠將其充分合理地應用到臨床工作中，從而達到良好的組織修復效果。
來源：常堯仁,劉純,殷麗華.富血小板纖維蛋白衍生物的研究進展[J].華西口腔醫學雜誌,2019,37(06):660-665.
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